0031] 2)培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱擊；
[0032] 3)接種重組桿狀病毒；
[0033] 4)收獲細(xì)胞懸液，檢測(cè)目的蛋白含量。
[0034] 優(yōu)選的，步驟1)中所用的基質(zhì)細(xì)胞系為Sf9細(xì)胞。
[0035] 優(yōu)選的，步驟3)中采用的桿狀病毒為含有外源蛋白表達(dá)基因的重組桿狀病毒。
[0036] 本發(fā)明采用的生物反應(yīng)器可以帶有斜三葉槳或稱(chēng)為el印hantear槳；或者，所用 的生物反應(yīng)器為一次性攪拌式生物反應(yīng)器。
[0037] 優(yōu)選的，步驟1)中所述的生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞工藝包含放大工藝，單級(jí)培養(yǎng)中所 用種子細(xì)胞為搖瓶懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，放大培養(yǎng)所用種子細(xì)胞為生物反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)所獲細(xì) 胞。單級(jí)培養(yǎng)為14L生物反應(yīng)器單級(jí)培養(yǎng)模式，放大培養(yǎng)為14L到42L放大模式。具體放大 方法為將搖瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞，稀釋后轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，達(dá)到一定密度后繼續(xù)稀釋?zhuān)?導(dǎo)入新的更大體積的生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)，依次方法放到所需要的規(guī)模。
[0038] 優(yōu)選的，步驟1)所述的生物反應(yīng)器培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞方式為補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式。
[0039] 優(yōu)選的，步驟1)中所述的生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞條件為：溫度25~28°C，攪拌轉(zhuǎn)速 為20~60rpm，溶氧（DO)為30~60%，pH值為6. 0~6. 4。
[0040] 優(yōu)選的，步驟1)中所述的生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基為昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清 培養(yǎng)基（例如，倍進(jìn)SF20112-4)。
[0041] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明中接種細(xì)胞密度為0. 5~1. 5X106個(gè)/ml，接種 前的細(xì)胞總量達(dá)到〇. 6~0. 9X107cells/ml。
[0042] 本發(fā)明的生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式為補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式。
[0043] 在生物反應(yīng)器培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱擊，是指：在接種后60~72 小時(shí)，將培養(yǎng)溫度上升1~5°C，并維持1~8小時(shí)，之后將溫度恢復(fù)正常。
[0044] 生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白按照適當(dāng)比例接種重組桿狀病毒，接種病毒的比例一般 為MOI= 5~15。MOI即病毒感染附屬（MultiplicityOfInfection)的英文縮寫(xiě)，直觀(guān) 來(lái)講就是總病毒數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，通過(guò)取樣計(jì)數(shù)接種病毒前細(xì)胞濃度來(lái)確定接種病毒 量。
[0045] 本發(fā)明中，進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟3)所述的病毒培養(yǎng)工藝為補(bǔ)料培養(yǎng)工 藝，即，在接種病毒后，間歇補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物等任一 或其組合。
[0046] 其中，細(xì)胞懸液的收獲可以采用分批收獲方式。
[0047] 優(yōu)選的，步驟4)檢測(cè)外源蛋白中將收獲的細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲破碎，將懸浮物進(jìn)行 離心，去除碎片，取上清，例如可使用PCV2-Cap蛋白定量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：P1001)檢測(cè)收 獲液中目的產(chǎn)物的濃度（檢測(cè)曲線(xiàn)可參閱圖3)。
[0048] 以下將結(jié)合典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行更為清楚、完整的描述。但本發(fā) 明的實(shí)施方案并不局限于此。
[0049] 實(shí)施例1:本實(shí)施例采用的反應(yīng)器為賽多利斯攪拌式14L反應(yīng)器和42L反應(yīng)器，為 斜三葉槳，采用的基質(zhì)細(xì)胞為Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)基為SF-SFM(蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司）， 而采用的含有外源基因的重組桿狀病毒為帶有PCV-2殼蛋白的重組桿狀病毒（上海米迪生 物技術(shù)有限公司）。其工藝流程包括：
[0050] (1)搖瓶及生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備
[0051] 將搖瓶徹底清洗，錫箔紙分別包扎搖瓶，進(jìn)行高壓滅菌，121 °C，30min，自然冷卻至 室溫，轉(zhuǎn)移至烘箱中烘干備用。
[0052] 將生物反應(yīng)器罐體進(jìn)行徹底清洗，將pH進(jìn)行標(biāo)定后及DO電極安裝到罐體上，包 扎管道接口并進(jìn)行驗(yàn)漏實(shí)驗(yàn)。完成后生物反應(yīng)器進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121°C， 30min。將無(wú)菌過(guò)濾好的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基無(wú)菌連接到反應(yīng)器上，通過(guò)懦動(dòng)泵導(dǎo)入罐體，培養(yǎng) 基的最少加入量以浸沒(méi)電極探頭為標(biāo)準(zhǔn)，并打開(kāi)反應(yīng)器溫度、攪拌及通氣控制進(jìn)行培養(yǎng)基 的平衡和預(yù)熱，并對(duì)DO電極進(jìn)行校正，過(guò)夜待用。
[0053] (2)生物反應(yīng)器制備基質(zhì)細(xì)胞
[0054] 具體步驟為，將搖瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞導(dǎo)入生物反應(yīng)器中，并補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，使得 生物反應(yīng)器中細(xì)胞懸液的密度為1X106個(gè)/ml，設(shè)定生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝條件為：溫度為 27 °C，攪拌轉(zhuǎn)速為60rpm，DO40 %，pH6. 3。每天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3X106 個(gè)/ml，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到42L反應(yīng)器中，并補(bǔ)充培養(yǎng)基，使得細(xì)胞密度為1X106個(gè)/ml，設(shè)定 培養(yǎng)條件為27°C，攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm，DO40%，pH6. 3。細(xì)胞生長(zhǎng)周期一般為72小時(shí)。
[0055] (3)進(jìn)行熱擊
[0056] 細(xì)胞取樣后，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。在培養(yǎng)72h后，細(xì)胞密度達(dá)到8X106cells/ml，升高 培養(yǎng)溫度至29. 5°C，并維持8小時(shí)，之后恢復(fù)培養(yǎng)溫度至27°C。
[0057] (4)接種病毒
[0058] 按照MOI=1接種含有外源基因的重組桿狀病毒。
[0059] (5)繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲細(xì)胞懸液。
[0060] (6)將收獲的細(xì)胞懸液進(jìn)行三次反復(fù)凍融，使用ELISA檢測(cè)外源蛋白濃度為 494mg/L〇
[0061] 對(duì)照例1 :該對(duì)照例采用的反應(yīng)設(shè)備及原料與實(shí)施例相同，其工藝流程包括：
[0062] 1)搖瓶及生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備
[0063] 將搖瓶徹底清洗，錫箔紙分別包扎搖瓶，進(jìn)行高壓滅菌，121 °C，30min，自然冷卻至 室溫，轉(zhuǎn)移至烘箱中烘干備用。
[0064] 將生物反應(yīng)器罐體進(jìn)行徹底清洗，將pH電極進(jìn)行標(biāo)定后及DO電極安裝到罐體上， 包扎管道接口并進(jìn)行驗(yàn)漏實(shí)驗(yàn)。完成后生物反應(yīng)器進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121°C， 30min。將無(wú)菌過(guò)濾好的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基無(wú)菌連接到反應(yīng)器上，通過(guò)懦動(dòng)泵導(dǎo)入罐體，培養(yǎng) 基的最少加入量以浸沒(méi)電極探頭為標(biāo)準(zhǔn)，并打開(kāi)反應(yīng)器溫度、攪拌及通氣控制進(jìn)行培養(yǎng)基 的平衡和預(yù)熱，對(duì)DO進(jìn)行校正，過(guò)夜待用。
[0065] 2)生物反應(yīng)器制備基質(zhì)細(xì)胞
[0066] 具體步驟為，將搖瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞導(dǎo)入生物反應(yīng)器中，并補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，使得 生物反應(yīng)器中細(xì)胞懸液的密度為1X106個(gè)/ml，設(shè)定生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝條件為：溫度為 27 °C，攪拌轉(zhuǎn)速為60rpm，DO40%，pH6. 3。每天取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3X106 個(gè)/ml，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到42L反應(yīng)器中，并補(bǔ)充培養(yǎng)基，使得細(xì)胞密度為0. 8X106個(gè)/ml，設(shè) 定培養(yǎng)條件為27°C，攪拌轉(zhuǎn)速為35rpm，DO40%，pH6. 3。細(xì)胞生長(zhǎng)周期一般為12小時(shí)。
[0067] 3)接種病毒
[0068] 細(xì)胞取樣后，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。在培養(yǎng)12h后，細(xì)胞密度達(dá)到1.5X106cells/ml，按 照M0I= 1接種含有外源基因的重組桿狀病毒。
[0069] 5)繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲細(xì)胞懸液。
[0070] 6)將收獲的細(xì)胞懸液進(jìn)行三次反復(fù)凍融，使用ELISA檢測(cè)外源蛋白濃度為65mg/ L〇
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 本實(shí)施例采用的反應(yīng)器為賽多利斯攪拌式14L反應(yīng)器和42L反應(yīng)器，為斜三葉槳， 采用的基質(zhì)細(xì)胞為Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)基為SF-SFM(蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司），而采用的 含有外源基因的重組桿狀病毒為含有GFP外源基因的重組桿狀病毒（上海米迪生物技術(shù)有 限公司）。其工藝流程包括：
[0073] (1)搖瓶及生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備
[0074] 將搖瓶徹底清洗，錫箔紙分別包扎搖瓶，進(jìn)行高壓滅菌，121 °C，30min，自然冷卻至 室溫，轉(zhuǎn)移至烘箱