提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外源蛋白效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外源蛋白的方法，特別涉及一種 提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外源蛋白的方法，屬于外源蛋白表達制備技術領域。
【背景技術】
[0002] 近20年來昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統（BEVS)被成功應用于表達了很多外源蛋 白。目前有三個相對比較好的細胞系具有良好的性質，適用于AcMNPB和BmNPV重組蛋白表 達的研宄和生產，其包括：來源于秋粘蟲卵巢組織的IPLB-SF21AE(Sf21)細胞系及其衍生 株Sf9,來自甘藍尺鑊的BTITN5Bl-4(HighFive)細胞系，以及來源于家蠶卵巢的BmN及其 亞系。其中Sf9是其中應用比較廣泛的細胞株，現在有很多產品都應用昆蟲桿狀病毒表達 外源蛋白，尤其是VLP作為疫苗。
[0003] 昆蟲細胞屬于半貼壁細胞，可以使用含有10 %的胎牛血清（FBS)培養，也可以進 行無血清貼壁培養，為了更加適應大規模生產，現在一般均進行無血清懸浮培養，現有的利 用BEVS系統表達蛋白制備疫苗均采用懸浮培養的方式進行。因此在整個工藝過程中，細胞 系的倍增時間、細胞密度、細胞對病毒敏感性和細胞表達外源基因的能力成為主要的考慮 因素。
[0004] 目前國內外已經利用昆蟲-桿狀病毒表達系統已經成功開發上市了多種疫苗產 品，包括人用上市疫苗、獸用上市疫苗等。將目標基因經過優化，然后通過分子生物學手段， 構建獲得充足桿狀病毒，再通過桿狀病毒感染昆蟲細胞，經過獲得目標蛋白，再經過各種純 化手段獲得符合要求的目標產物，是目前利用昆蟲-桿狀病毒系統開發疫苗產品的基本思 路。一方面昆蟲細胞生產的蛋白質較原核和低等真核表達系統更容易糖基化，是蛋白質更 加接近天然活性狀態，另一方面利用桿狀病毒表達病毒蛋白較293細胞和CHO細胞表達系 統更具有優勢。因為以上優勢，有多種利用該表達系統生產的疫苗處于臨床期或者研發期。
[0005] 目前，使用昆蟲桿狀病毒表達系統進行蛋白表達，雖然已經實現了 1000L的生產 規模，但是在昆蟲細胞桿狀病毒表達系統使用過程中存在一個重要的影響因素一一 "細胞 密度效應"，即在接種桿狀病毒時，細胞密度應低于3X106cells/ml，更為有效的是應低于 2X106cell/ml，高于該細胞密度接種病毒外源蛋白表達量不會提高甚至會下降。盡管有報 道稱，使用灌注培養工藝，可以提高接種病毒時的細胞密度，外源蛋白表達量也會提高，但 昆蟲細胞耗氧量極高，使用灌注培養現有的生物反應器難以維持。而且目前該系統蛋白表 達量僅在15mg/L左右，對產品后期的純化帶來了比較大的挑戰。同時，昆蟲細胞在一般商 業化無血清培養基中的批培養最大細胞密度可以達到1X107cells/ml，在某些特殊的無血 清培養基中批培養可以達到2.3X107cells/ml，但是僅在低密度時接種病毒，會造成培養 基的嚴重浪費。
【發明內容】
[0006] 本發明的主要目的在于提供一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外源蛋白 效率的方法，以克服現有技術中的不足。
[0007] 為實現前述發明目的，本發明采用的技術方案包括：
[0008] 一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外源蛋白效率的方法，包括：
[0009] (1)在培養基中培養基質細胞；
[0010] (2)在基質細胞的培養過程中對基質細胞進行熱擊；
[0011] ⑶接種桿狀病毒；
[0012] (4)收獲細胞懸液及提取表達的外源蛋白。
[0013] 在一較為優選的實施方案之中，步驟（1)包括：以Sf9細胞作為基質細胞進行培 養。
[0014] 進一步的，步驟（1)中基質細胞的培養條件包括：溫度為25~28°C，攪拌轉速為 20~60rpm，溶氧為30~60 %，pH值為6. 0~6. 4。
[0015] 在一較為優選的實施方案之中，該方法包括：在培養基中接種基質細胞至細胞密 度為0. 5X106~1. 5X10 6個/ml后進行培養，且在接種桿狀病毒前，培養基中的基質細胞 總量達到6X106~1X10 7個/ml。
[0016] 在一較為優選的實施方案之中，步驟（2)包括：在接種基質細胞后60~72h，將培 養溫度上升1~5°C，并維持1~8小時，之后將溫度恢復至正常培養溫度。
[0017] 進一步的，所述培養基優選為昆蟲細胞無血清培養基。
[0018] 在一較為優選的實施方案之中，步驟（3)包括：按照MOI= 5~15接種桿狀病毒。
[0019] 在一較為優選的實施方案之中，所述桿狀病毒優選為含有PCV-2病毒殼蛋白基因 的重組桿狀病毒。
[0020] 在一較為優選的實施方案之中，該方法包括：采用補料分批培養方式培養基質細 胞。
[0021] 在一較為優選的實施方案之中，該方法還包括：在接種桿狀病毒后，間歇補加營養 物質，所述營養物質包括葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物中的任一種或兩種以上的 組合。
[0022] 相對于現有的昆蟲細胞桿狀病毒表達系統來說，本發明方法中利用無血清培養 基培養昆蟲細胞，例如Sf9昆蟲細胞，并且不因為"細胞密度效應"而在細胞生長到1. 5~ 3X106個/ml時接種桿狀病毒啟動外源基因表達。造成"細胞密度效應"的本質是當細胞 達到某個細胞密度后，這個時期S期細胞占得的比例及總量最多，當細胞密度繼續升高，S 期細胞比例和數量都下降很快，所以即使提高接種病毒時候的細胞密度并相應增加病毒接 種量也不能提高甚至是降低外源基因的表達量。當細胞增長至需要的密度，對細胞進行一 定時間的熱擊，之后恢復正常培養溫度，細胞中S期細胞比例顯著增加。S期細胞增加為病 毒侵染提供了良好的條件。可以實現病毒在高細胞密度下的侵染。故在本發明中采用高細 胞密度接種病毒，例如在0. 6~1X107個/ml進行接毒，接種細胞密度較原來提高了 3~6 倍。同時通過熱擊效應提高了細胞中S期細胞比例，使得單細胞產量提高，在提高接種細胞 密度和單細胞產量增加雙重作用下，可以顯著提高接種病毒后外源蛋白的表達量。
[0023] 又及，傳統工藝中，接種病毒后一般采用分批培養的方式，不進行任何補充營養物 質的操作。但是在本發明中，接種病毒后進行分批補料培養，對其進行營養物質補充，保證 表達外源蛋白時細胞所需營養物質充足。
[0024] 總之，與現有技術相比，藉由本發明的方法中，可以顯著提高接種病毒時細胞密 度，進而大幅提高了單位體積內外源蛋白的表達量，特別是，較之現有的接種病毒工藝，外 源蛋白表達量可以提高7. 6倍以上，可以極大擴展該表達系統于大規模工業化生產疫苗等 生物制品中的應用。
【附圖說明】
[0025]圖1是為本發明一實施例中利用熱擊提高生物反應器領用昆蟲桿狀病毒表達系 統表達外源蛋白的工藝流程圖；
[0026] 圖2是在使用熱擊（實施例1)和未使用熱擊（對照例1)的條件下，生物反應器 中細胞的生長曲線圖；
[0027] 圖3是本發明一實施方案之中一種試劑盒標準品的檢測標準曲線。
【具體實施方式】
[0028] 針對現有技術中在利用昆蟲桿狀病毒表達系統進行蛋白表達時所存在的蛋白表 達量低，培養基浪費嚴重等不足，本案發明人在長期研宄和大量實踐中，非常意外的發現， 采用熱擊法能夠令人驚喜的大幅提高昆蟲桿狀病毒表達系統的表達效率。基于此發現，本 案發明人得以提出本發明的技術方案，如下進行具體解釋說明。
[0029] 在本發明的一實施方案之中，提供了一種提高利用昆蟲桿狀病毒表達系統表達外 源蛋白效率的方法，其包括以下步驟：
[0030] 1)應用攪拌式生物反應器培養基質細胞；
[