gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatg atctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtca gcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg ggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctc tacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctct gcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO :2)，其中帶有下劃線的 序列為可變區序列。
[0079] 抗體MIL41的輕鏈氨基酸序列為：
[0080] DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAffYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO ：3)；
[0081] 抗體MIL41的重鏈氨基酸序列為：
[0082] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :4)。
[0083] 實施例2抗體MIL41基因的克隆
[0084] 實駘材料:
[0085] Phusion聚合酶、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、pGEM-T-easy載體、Pyrobest DNA polymerase均為NEB公司產品；
[0086] dNTP、DNA Marker 標準為 TaKaRa 產品；
[0087] DNA回收試劑盒為Qiagen公司產品；
[0088] Trans2_Blue感受態為全式金公司產品；
[0089] 小提中量質粒試劑盒（DP107-02)為天根生化公司產品；
[0090] 大提質粒試劑盒（DP117)為天根生化公司產品；
[0091] OPD為Sigma公司產品；
[0092] FITC標記的羊抗人抗體：為Pierce公司產品；
[0093] 引物設計為Biosun軟件；
[0094] 引物合成（Genewiz),金唯智生物科技（北京）有限公司；
[0095] 基因測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。
[0096] 實駘方法和結果:
[0097] 通過PCR的方法合成抗體的輕重鏈可變區基因，即為MIL41抗體的輕重鏈可變區 基因。測序正確的克隆，裝配表達質粒。使用PCR技術全合成MIL41/VH、MIL41/Vk基因片 段，并引入合適的酶切位點，在抗體輕鏈可變區基因5,和3,端引入ClaI和BsiwI位點，在 抗體重鏈可變區基因5,和3,端引入EcoR I和Nhe I位點。
[0098] 2. 1弓丨物設計
[0099] 根據基因全合成的原理，利用計算機輔助設計軟件，設計引物，考慮引物的二級結 構、GC含量等相關參數。每條基因設計10條引物，分別編號為PI、P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9和P10,用于基因全合成。
[0100] 2. 2全基因合成
[0101] 1)引物合成后以無菌水稀釋，方法如下：
[0102] a)取引物管12000rpm離心2min，引物按100μΜ的濃度稀釋，-20°C保存；
[0103] b)取少量引物P2~P9混合成終濃度為10 μ M作為使用液；
[0104] c)取少量引物Pl和PlO混合稀釋成終濃度為10 μ M作為使用液Ρ1/Ρ10 ;
[0105] 2)基因全合成，米用Pyrobest DNA polymerase,方法如下：
[0106] a)取1 μ L P2~P9混合引物作為模版，配制如下Overlap PCR體系：
[0107] P2~P9混合引物 ΙμL dNTP 3 μ L IOX Buffer 5μL Pyrobest DNA polymerase 0.3 μ L P1/P10引物 4 μ L(引物先不加 )
[0108] 無菌水補足總體積為50uL
[0109] b)將以上PCR體系進行如下反應：
[0110]
【主權項】
1. 編碼抗J1ER2人源化抗體的核酸分子，其輕鏈的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其 重鏈的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
2. 重組載體，其含有權利要求1的核酸分子。
3. 重組細胞，其含有權利要求2的重組載體； 優選地，所述細胞為哺乳動物細胞，例如為CHO-Kl細胞； 進一步優選地，所述哺乳動物細胞為經過目標培養基馴化后的細胞。
4. 抗HER2人源化抗體，其由權利要求1的核酸分子、權利要求2的重組載體、或者權利 要求3的重組細胞制備得到。
5. 權利要求4的抗HER2人源化抗體，其中所述VHS異構體的含量為0~0. 4%，例如為 0 ~0? 2%、0 ~0? 1%。
6. 權利要求4的抗HER2人源化抗體，其中所述NGHC異構體的含量為0. 2%~1%，例如 為 0? 3% ~0? 75%。
7. 權利要求5或6的抗HER2人源化抗體的制備方法，其包括利用權利要求1的核酸分 子、權利要求2的重組載體、或者權利要求3的重組細胞制備該抗HER2人源化抗體的步驟。
8. 權利要求7的制備方法，其具體包括以下步驟： 1) 將權利要求1的核酸分子的核苷酸序列克隆入表達載體中，得到重組表達載體，優 選地，所述表達載體是在載體pTGS-FRT-DHFR的基礎上改造獲得，優選地，所述改造是指去 除潮霉素選擇標簽，并加入谷氨酰胺合成酶表達盒子； 2) 將重組表達載體轉入宿主細胞，例如CHO-Kl細胞中，得到重組宿主細胞，優選地，所 述宿主細胞是經過目標培養基馴化后的CHO-Kl細胞； 3) 將步驟2)獲得的重組宿主細胞在目標培養基中進行培養，獲得能夠高效表達抗體的 單克隆細胞株； 4) 逐步放大培養步驟3)獲得的單克隆細胞株，收獲培養上清； 5) 將步驟4)獲得的培養上清進行純化獲得權利要求4 一 6任一項的抗HER2人源化抗 體；優選地，所述純化包括親和層析、陰離子交換層析和陽離子交換層析。
9. 組合物，其含有權利要求4 一 6任一項的抗HER2人源化抗體； 優選地，其中VHS異構體的含量為0~0. 4%，例如為0~0. 2%、0~0. 1% ;和/或 優選地,其中NGHC異構體的含量為0. 2%~1%，例如為0. 3%~0. 75%。
10. 權利要求1的核酸分子、權利要求2的重組載體、或者權利要求3的重組細胞在制 備抗HER2人源化抗體中的用途； 其中所述抗J1ER2人源化抗體輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其重鏈可 變區的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
11. 權利要求4 一 6任一項的抗HER2人源化抗體在制備抗腫瘤藥物中的用途；優選地， 所述腫瘤例如為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌或胃癌。
【專利摘要】本發明涉及一種抗HER2人源化抗體，以及編碼所述抗HER2人源化抗體的核酸分子。本發明還涉及所述抗HER2人源化抗體的制備方法，所述核酸分子用于制備所述人源化抗體的用途，以及所述人源化抗體用于制備抗腫瘤藥物的用途。與現有的抗HER2人源化抗體相比，本發明的抗HER2人源化抗體純度更高，更有利于保證大規模生產中抗體產品的品質。
【IPC分類】C12N15-85, C07K16-28, C12N15-13, C12N5-10, A61P35-00, A61K39-395
【公開號】CN104726462
【申請號】CN201310711457
【發明人】耿樹生, 葉培, 盛曉麗, 劉旭, 趙健, 謝波
【申請人】北京天廣實生物技術股份有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年12月20日