抗her2人源化抗體mil41、其制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗HER2人源化抗體，以及編碼所述人源化抗體的核酸分子。本發 明還涉及所述核酸分子用于制備所述抗HER2人源化抗體的用途，以及所述人源化抗體用 于制備抗腫瘤藥物的用途。
【背景技術】
[0002] HER2 (ERBB2)是I型跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，在許多上皮來源的腫瘤細胞 中過表達，如25-30%的乳腺癌、25-32%的卵巢癌、30-40%的原發性腎細胞癌等，是腫瘤靶向 藥物研制的重要靶點。
[0003] Genentech公司研發的人源化抗體帕妥珠（Pertuzumab，也被稱作2C4,商品名 Per jeta)，通過結合HER2,阻斷了 HER2與HER3之間的聯系，而HER2與HER3是HER家族初 始致癌信號傳導的最強二聚體形式，這種相互作用在許多不同類型腫瘤的增殖和形成中均 起重要作用。Pertuzumab對HER2低水平表達的腫瘤細胞也有作用。帕妥珠單抗在2012年 6月8日通過了美國FDA的認證，用于治療HER2陽性的轉移性乳腺癌。
[0004] 通過檢索相關的文獻以及專利（中國發明專利【申請號】200580031905. 4)，我們獲 悉Pertuzumab在生產過程中存在序列異構體VHS的問題，這會影響最終產品的純度。本發 明研究的目的是獲得無 VHS異構體或低VHS異構體含量的抗體產品。
【發明內容】
[0005] 本發明的發明人通過計算機設計、優化和大量的實驗摸索，驚奇地發現通過改變 抗體帕妥珠的核苷酸序列，以及接下來的克隆、表達策略，可以克服該抗體在表達中出現的 VHS異構體現象，從而大大提高產品的純度。具體地，本發明包括以下幾個方面：
[0006] 本發明第一方面涉及編碼抗HER2人源化抗體的核酸分子，其輕鏈的核苷酸序列 如SEQ ID NO :1所示，其重鏈的核苷酸序列如SEQID NO :2所示。
[0007] 本發明第二方面涉及重組載體，其含有本發明第一方面任一項的核酸分子。
[0008] 在本發明中，所述載體可以為克隆載體或表達載體。所述載體含有本發明第一方 面所述的核酸分子，所述載體可以通過例如將上述核酸分子插入克隆載體或表達載體而得 到，或者可以通過人工合成得到。
[0009] 所述表達載體例如為原核表達載體，真核表達載體，噬菌體載體或病毒載體。其 中所述原核表達載體例如為PET載體、PGEX載體，所述真核表達載體例如為pcDNA3. 1、 pEGFP_Cl、pPIC9K，所述噬菌體載體例如為λ噬菌體載體入8丨、入8卜入8，所述病毒載體例 如為逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關病毒載體。
[0010] 在本發明的實施方案中，所述載體為真核表達載體PTGS-FRT-DHFR。
[0011] 在本發明的實施方案中，將真核表達載體pTGS-FRT-DHFR做了進一步改造。在本 發明的實施方案中，所述改造方法為去除潮霉素選擇標簽，并加入谷氨酰胺合成酶表達盒 子。在本發明的具體實施方案中，所述表達載體為載體GS。
[0012] 在本發明中，在所述真核表達載體pTGS-FRT-DHFR或載體GS中連接SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2的序列后，即得到重組載體。
[0013] 本發明第三方面涉及重組細胞，其含有本發明第二方面任一項的重組載體。
[0014] 根據本發明第三方面任一項的重組細胞，其為哺乳動物細胞。在本發明的實施方 案中，所述哺乳動物細胞為適合表達人源化抗體的細胞，例如來源于人、鼠或猴的哺乳動物 細胞。在本發明的實施方案中，所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
[0015] 在本發明的實施方案中，所述哺乳動物細胞為CHO-Kl細胞。
[0016] 在本發明的具體實施方案中，所述CHO-Kl細胞是經過目標培養基馴化后的細胞。
[0017] 在本發明的實施方案中，所述目標培養基是指無血清、化學成分確定的動物細胞 培養基。
[0018] 在本發明的實施方案中，所述目標培養基中含有PluroniC F-68、葡萄糖、培養基 干粉Maxgrow202、碳酸氫鈉、氯化鈉和HEPES ;
[0019] 在本發明的具體實施方案中，所述目標培養基的成分為PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培養基干粉Maxgrow2027· 44g/L、碳酸氫鈉 I. 98g/L、氯化鈉3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并調節pH至7. 0 ±0. 1。在本發明的具體實施方案中，所述目標培養基用于細 胞馴化和種子培養。在本發明的實施方案中，所述目標培養基為表1-1的種子培養基。
[0020] 在本發明的實施方案中，所述馴化培養的方法為本領域所公知，例如先將細胞在 含有10%小牛血清的目標培養基中貼壁培養，按照50%的比例逐級去除血清，例如小牛血清 濃度從10%逐級降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后繼續傳代數次，至宿主細胞 完全懸浮，成倍增長穩定，最終獲得能夠在目標培養基中生長的穩定宿主細胞。
[0021] 本發明的第四方面涉及抗HER2人源化抗體，其由本發明第一方面任一項的核酸 分子、第二方面任一項的重組載體、或者第三方面任一項的重組細胞制備得到。
[0022] 在本發明的實施方案中，所述抗HER2人源化抗體中VHS異構體的含量為0~ 〇· 4%，例如為 0 ~0· 2%、0 ~(λ 1%。
[0023] 在本發明的實施方案中，所述抗HER2人源化抗體中NGHC異構體的含量為0. 2%~ 1%，例如為 0. 3% ~0. 75%。
[0024] 在本發明的實施方案中，所述VHS異構體的定量方法為電荷變量分析法(也即陽 離子交換分析法)。
[0025] 在本發明的實施方案中，所述NGHC異構體的定量方法為還原型的毛細管凝膠電 泳分析法（CE-SDS)。
[0026] 本發明的第五方面涉及本發明第四方面任一項的抗HER2人源化抗體的制備方 法，其包括利用本發明第一方面任一項的核酸分子、第二方面任一項的重組載體、或者第三 方面任一項的重組細胞制備該抗HER2人源化抗體的步驟。
[0027] 根據本發明第五方面任一項的制備方法，其具體包括以下步驟：
[0028] 1)將本發明第一方面的核酸分子的核苷酸序列克隆入表達載體中，得到重組表達 載體，優選地，所述重組表達載體是在載體pTGS-FRT-DHFR的基礎上改造獲得，優選地，所 述改造是指去除潮霉素選擇標簽，并加入谷氨酰胺合成酶表達盒子；
[0029] 2)將重組表達載體轉入宿主細胞，例如CHO-Kl細胞中，得到重組宿主細胞，優選 地，所述宿主細胞是經過目標培養基馴化后的CHO-Kl細胞；
[0030] 3)將步驟2)獲得的重組宿主細胞在目標培養基中進行培養，獲得能夠高效表達抗 體的單克隆細胞株。
[0031] 4)逐步放大培養步驟3)獲得的單克隆細胞株，收獲培養上清；
[0032] 5)將步驟4)獲得的培養上清進行純化，獲得本發明第四方面任一項的抗HER2人 源化抗體。
[0033] 在本發明的實施方案中，所述重組表達載體是GS載體。
[0034] 在本發明的實施方案中，所述目標培養基是指無血清、化學成分確定的動物細胞 培養基。
[0035] 在本發明的實施方案中，所述目標培養基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培養基 干粉Maxgrow202、碳酸氫鈉、氯化鈉和HEPES ;
[0036] 在本發明的具體實施方案中，所述目標培養基的成分為PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培養基干粉Maxgrow2027. 44g/L、碳酸氫鈉 I. 898g/L、氯化鈉3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并調節pH至7. 0 ± 0. 1。在本發明的具體實施方案中，所述目標培養基用于細 胞馴化和種子培養。在本發明的實施方案中，所述目標培養基為表1-1的種子培養基。
[0037] 在本發明的實施方案中，所述馴化培養的方法為本領域所公知，例如先將細胞在 含有10%小牛血清的目標培養基中貼壁培養，按照50%的比例逐級去除血清，例如小牛血清 濃度從10%逐級降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后繼續傳代數次，至宿主細胞 完全懸浮，成倍增長穩定，最終獲得能夠在目標培養基中生長的穩定宿主細胞。
[0038] 在本發明的實施方案中，步驟3)的具體方法為：將步驟2)獲得的重組宿主細胞在 目標培養基中進行培養，向培養基中加入適當濃度的MSX (例如75 μ M MSX)，在培養箱中培 養一段時間，挑選出可以在此培養基中存活并表達抗體的細胞，然后進行亞克隆篩選，獲得 能夠高效表達抗體的單克隆細胞株。
[0039] 在本發明的實施方案中，步驟4)的具體方法為：將能夠高效表達抗體的單克隆細 胞株經過目標培養基多步擴大培養，培養基為生產培養基：種子培養基為1 :1，培養周期為 12-14天，培養第3、6、9天加入10%體積的流加培養基，培養結束后收獲上清。
[0040] 在本發明的具體實施方案中，所述種子培養基即為目標培養基。
[0041] 在本發明的實施方案中，所述生產培養基中含有氫氧化鈉、培養基干粉 Maxpr〇302、維生素 Β12、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉一水合物、葡萄糖、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水 合物、Pluronic F-68、氯化鈉、HC1、碳酸氫鈉和HEPES。
[0042] 在本發明的具體實施方案中，所述生產培養基中含有氫氧化鈉0. 8g/L、培養 基干粉Maxpro30211. 5g/L、lg/L維生素 B12貯存液（1-2) ml/L、10g/L硫酸亞鐵貯存液 (0· 4-0. 6) ml/L、磷酸二氫鈉一水合物0· 35g/L、葡萄糖8. 8g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合 物（0· 3-0. 375)g/L、Pluronic F-681g/L、氯化鈉 I. 55g/L、5M HC15. 6ml/L、碳酸氫鈉 I. 22g/ L和IM HEP