胞-水凝膠混合物。此細(xì)胞-水凝膠混合物可直接施用于受損組織。舉例來說，如美國專利第5，944，754號(hào)中所述，水凝膠-細(xì)胞混合物可簡單地刷涂、浸漬或噴涂到所需表面上，或者傾倒或以其它方式施用以填充所需腔或裝置。水凝膠提供一種供細(xì)胞粘附和生長的薄基質(zhì)或骨架。當(dāng)與患者的病癥相關(guān)的組織具有不規(guī)則形狀時(shí)，或當(dāng)將細(xì)胞施用于遠(yuǎn)端部位時(shí)(例如，當(dāng)將類孢子細(xì)胞置于腎囊之下以治療糖尿病時(shí))，這些投藥方法可能特別適合。
[0070]或者，可將水凝膠-細(xì)胞混合物引入可滲透的生物相容性支撐物結(jié)構(gòu)中，以致所述混合物基本上填充支撐物結(jié)構(gòu)，并且當(dāng)其凝固時(shí)呈現(xiàn)支撐物結(jié)構(gòu)的形狀。因此，支撐物結(jié)構(gòu)可導(dǎo)引由置于其中的類孢子細(xì)胞或其子代成熟的組織的發(fā)育和形狀。如下文進(jìn)一步描述，支撐物結(jié)構(gòu)可在用水凝膠-細(xì)胞混合物填充之前或之后提供給患者。舉例來說，支撐物結(jié)構(gòu)可置于組織(例如皮膚、肝臟或骨骼系統(tǒng)的受損區(qū)域)內(nèi)，隨后使用注射器、導(dǎo)管或其它適合裝置用水凝膠-細(xì)胞組合物進(jìn)行填充。需要時(shí)，可使支撐物結(jié)構(gòu)的形狀符合受損組織的形狀。在以下小節(jié)中將描述適合的支撐物結(jié)構(gòu)、水凝膠和遞送方法。
[0071]水凝膠應(yīng)為生物相容、生物可降解的，能夠維持活細(xì)胞，且優(yōu)選能夠在體內(nèi)迅速(例如在遞送到支撐物結(jié)構(gòu)之后約5分鐘內(nèi))凝固。大量細(xì)胞可均勻分布于水凝膠內(nèi)。水凝膠通?？芍渭s5X 16個(gè)細(xì)胞/毫升。水凝膠還能夠擴(kuò)散以使養(yǎng)分到達(dá)細(xì)胞并帶出廢物。
[0072]可使用多種不同的水凝膠。這些水凝膠包括(但不限于):(1)在體溫下凝固或凝結(jié)的溫度相關(guān)性水凝膠(例如PLURONICS?) ;(2)通過離子交聯(lián)的水凝膠(例如海藻酸鈉)；
(3)通過曝露于可見光或紫外光凝結(jié)的水凝膠(例如具有丙烯酸酯端基的聚乙二醇聚乳酸共聚物)；和(4)在pH改變時(shí)凝結(jié)或凝固的水凝膠(例如TETRONICS?)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于合成上述其它聚合物的方法。參看例如聚合物科學(xué)與工程簡明百科全書(ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering), J.1.克洛維茲(J.1.Kroschwitz)編，約翰威立出版公司(John Wiley and Sons),紐約州紐約市(New York, N.Y.), 1990o許多聚合物，例如聚(丙烯酸)、海藻酸鹽和PLURONICS?都是市售的。
[0073]可使用離子型多糖(例如海藻酸鹽或殼聚糖)來懸浮活細(xì)胞，包括類孢子細(xì)胞和其子代。這些水凝膠可通過使海藻酸(一種從海藻分離的碳水化合物聚合物)的陰離子鹽與例如鈣陽離子等離子交聯(lián)來制造。水凝膠的強(qiáng)度隨鈣離子或海藻酸鹽的濃度增加而增加。美國專利第4，352，883號(hào)描述了海藻酸鹽與二價(jià)陽離子在水中于室溫下發(fā)生離子交聯(lián)，形成水凝膠基質(zhì)。
[0074]將類孢子細(xì)胞子群與海藻酸鹽溶液混合。將所述溶液遞送到已經(jīng)植入的支撐物結(jié)構(gòu)，隨后其因體內(nèi)生理濃度的鈣離子的存在而在短時(shí)間內(nèi)凝固。或者，在植入前將溶液遞送到支撐物結(jié)構(gòu)，并使其在含鈣離子的外部溶液中凝固。
[0075]一般說來，這些聚合物可至少部分溶于水溶液(例如水、具有帶電側(cè)基的水性醇溶液或其單價(jià)離子鹽)。存在許多帶有可與陽離子(例如聚(磷腈)、聚(丙烯酸)和聚(甲基丙烯酸))反應(yīng)的酸性側(cè)基的聚合物的實(shí)例。酸性基團(tuán)的實(shí)例包括羧酸基團(tuán)、磺酸基團(tuán)和鹵代(優(yōu)選氟代)醇基團(tuán)。帶有可與陰離子反應(yīng)的堿性側(cè)基的聚合物的實(shí)例為聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)和聚(乙烯基咪唑)。
[0076]通過使帶有帶電側(cè)基的水溶性聚合物與含有帶相反電荷的多價(jià)離子的水溶液反應(yīng)來使聚合物交聯(lián)，所述多價(jià)離子當(dāng)所述聚合物具有酸性側(cè)基時(shí)為多價(jià)陽離子，或當(dāng)所述聚合物具有堿性側(cè)基時(shí)為多價(jià)陰離子。用于使聚合物與酸性側(cè)基交聯(lián)形成水凝膠的陽離子包括二價(jià)和三價(jià)陽離子，例如銅、鈣、鋁、鎂和鍶。將這些陽離子鹽的水溶液添加到聚合物中以形成柔軟、高度膨脹的水凝膠。
[0077]用于使聚合物交聯(lián)形成水凝膠的陰離子包括二價(jià)和三價(jià)陰離子，例如低分子量二羧酸根離子、對(duì)苯二甲酸根離子、硫酸根離子和碳酸根離子。將這些陰離子鹽的水溶液添加到聚合物中以形成柔軟、高度膨脹的水凝膠，如關(guān)于陽離子所述。
[0078]為防止抗體進(jìn)入水凝膠但允許養(yǎng)分進(jìn)入，水凝膠中有用聚合物的尺寸在介于1kDa與18.5kDa之間的范圍內(nèi)。較小的聚合物產(chǎn)生密度較高且孔較小的凝膠。
[0079]也可使用溫度相關(guān)性或熱敏感性水凝膠。這些水凝膠具有所謂的“反向膠凝(reversegelat1n) ”特性，即，其在室溫或低于室溫下為液體，并且當(dāng)升溫到較高溫度(例如體溫)時(shí)發(fā)生膠凝。因此，這些水凝膠易于在室溫或低于室溫下以液體形式施用，并且當(dāng)升溫到體溫時(shí)自動(dòng)形成半固體凝膠。結(jié)果，當(dāng)首先將支撐物結(jié)構(gòu)植入患者體內(nèi)，隨后用水凝膠-細(xì)胞組合物填充時(shí)，這些凝膠特別適用。所述溫度相關(guān)性水凝膠的實(shí)例為PLURONICS?(巴斯夫-萊多特公司(BASF-Wyandotte))，例如聚氧乙烯-聚氧丙烯F-108、F-68和F-127、聚(N-異丙基丙稀酰胺)和N-異丙基丙稀酰胺共聚物。
[0080]這些共聚物可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作以影響其物理特性，例如孔隙度、降解速率、轉(zhuǎn)變溫度和硬度。舉例來說，在鹽存在和不存在下添加低分子量糖會(huì)影響典型熱敏感性聚合物的下限臨界溶解溫度(lower critical solut1n temperature，LCST)。此外，當(dāng)通過在 4°C下分散來制備濃度在介于5%與25% (W/V)范圍內(nèi)的這些凝膠時(shí)，粘度和凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度會(huì)受到影響，所述凝膠-溶膠溫度與濃度呈反相關(guān)。這些凝膠具有能夠使類孢子細(xì)胞和其子代存活并得到滋養(yǎng)的擴(kuò)散特征。
[0081]美國專利第4，188，373號(hào)描述使用PLUR0NIC?多元醇的水性組合物來提供熱膠凝水性系統(tǒng)。美國專利第4，474，751號(hào)、第4，474，752號(hào)、第4，474，753號(hào)和第4，478，822號(hào)描述利用熱凝性聚氧亞烴基凝膠的藥物遞送系統(tǒng)。利用這些系統(tǒng)，凝膠轉(zhuǎn)變溫度和/或凝膠硬度二者都可通過調(diào)整PH值和/或離子強(qiáng)度以及聚合物的濃度加以改變。
[0082]其它適合的水凝膠具pH相關(guān)性。這些水凝膠在等于、低于或高于特定pH值下為液體，并且當(dāng)暴露于特定PH值(例如7.35到7.45，即人體內(nèi)細(xì)胞外流體的正常pH范圍)時(shí)膠凝。因此，這些水凝膠能夠以液體形式容易地遞送到植入的支撐物結(jié)構(gòu)，并在暴露于體內(nèi)PH時(shí)自動(dòng)形成半固體凝膠。所述pH相關(guān)性水凝膠的實(shí)例為TETRONICS? (巴斯夫-萊多特公司)、乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物、聚(甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-g_乙二醇)和聚(甲基丙烯酸2-羥基甲酯)。這些共聚物可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作以影響其物理特性。
[0083]可用于投予類孢子細(xì)胞或其子代的其它水凝膠可借助可見光或紫外光凝固。這些水凝膠由包括水溶性區(qū)域、生物可降解區(qū)域和至少兩個(gè)可聚合區(qū)域的大分子單體制成(參看例如美國專利第5，410，016號(hào))。舉例來說，水凝膠可以生物可降解、可聚合大分子單體開始，所述大分子單體包括核心、在核心每一端上的延伸和在每一延伸上的端帽(endcap)。所述核心為親水性聚合物，延伸為生物可降解聚合物，且端帽為能夠使大分子單體在曝露于可見光或紫外光(例如長波長紫外光)時(shí)交聯(lián)的寡聚物。
[0084]所述光凝固水凝膠的實(shí)例包括聚氧乙烯嵌段共聚物、具有丙烯酸酯端基的聚乙二醇聚乳酸共聚物以及兩端由丙烯酸酯封端的10K聚乙二醇-乙交酯共聚物。與PLUR0NIC?水凝膠相同，這些包含所述共聚物的水凝膠可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作以改變其物理特性，例如降解速率、結(jié)晶度差異和硬度。
[0085]水凝膠可通過注射或?qū)Ч芑蛘咴谥踩肫渌挝锝Y(jié)構(gòu)時(shí)投予。交聯(lián)可在投予之前、期間或之后發(fā)生。
[0086]除非另作定義，否則本文中使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解相同的含義。本文中引用的出版物以及這些出版物中引用的材料都明確地以引用的方式并入本文中。
[0087]實(shí)施例
[0088]使用專利申請(qǐng)案中所述的方法，從骨髓以及數(shù)個(gè)代表內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的組織中分離類孢子細(xì)胞群。分離后立即將細(xì)胞放入由DMEM/F12及抗生素B27、FGF和EGF構(gòu)成的稱為“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在此基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持?jǐn)?shù)周，在此期間，執(zhí)行連續(xù)研宄以鑒別這些細(xì)胞所表達(dá)的標(biāo)記物。使用基因表達(dá)分析和免疫組織化學(xué)針對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的鑒別來鑒別標(biāo)記物。
[0089]在暴露于“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”的同時(shí)，分析從代表內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的組織獲取的類孢子細(xì)胞中與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物的表達(dá)。從內(nèi)胚層組織(肺和肝臟)、中胚層組織(肌肉)和外胚層組織(脊髓和腎上腺)獲得的類孢子細(xì)胞群都表達(dá)與骨髓獲取的類孢子細(xì)胞相同的基因和蛋白質(zhì)標(biāo)記物組，并且當(dāng)維持于“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”中時(shí)不存在與骨髓源性類孢子細(xì)胞相同的標(biāo)記物。
[0090]隨后將細(xì)胞暴露于三種分化培養(yǎng)基中的一種:內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基、中胚層分化培養(yǎng)基和外胚層分化培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基的組成如下:
[0091]內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基:肝細(xì)胞培養(yǎng)基抗壞血酸、BSA-FAF,氫化可的松(hydrocortisone)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、hEGF、吉諾霉素(genomyosin)加10%胎牛血清。
[0092]中胚層分化培養(yǎng)基:DMEM加20%胎牛血清。
[0093]外胚層分化培養(yǎng)基:加有10%胎牛血清的由DMEM/F12加B27、BEDA FGF,EGF構(gòu)成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0094]當(dāng)將類孢子細(xì)胞群(包括從骨髓和所述代表性組織中每一者獲取的解聚細(xì)胞團(tuán))暴露于如上文所述補(bǔ)充的各“分化培養(yǎng)基”時(shí)，如由已知蛋白質(zhì)和基因標(biāo)記物的表達(dá)所確定，細(xì)胞根據(jù)所用培養(yǎng)基而分化成內(nèi)胚層、中胚層或外胚層的代表性細(xì)胞，即，當(dāng)使用內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞表達(dá)與內(nèi)胚層組織一致的以下蛋白質(zhì)標(biāo)記物:細(xì)胞角蛋白18、白蛋白和α胎蛋白。也表達(dá)基因標(biāo)記物GATA4。
[0095]當(dāng)使用中胚層分化培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞表達(dá)與中胚層組織一致的以下蛋白質(zhì)標(biāo)記物:肌球蛋白(myosin)、肌間線蛋白(desmin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白。也表達(dá)基因標(biāo)記物burachyury0
[0096]當(dāng)使用外胚層分化培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞表達(dá)與外胚層組織一致的以下蛋白質(zhì)標(biāo)記物:巢蛋白、Map20-1II微管蛋白(二者都為神經(jīng)元標(biāo)記物)、04(少突細(xì)胞的標(biāo)記物)、GFAPs (膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物)。Map2的表達(dá)也通過基因表達(dá)分析驗(yàn)證。
[0097]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，最普遍認(rèn)可的用以確定三種胚層的分化的標(biāo)記物是α胎蛋白(對(duì)于內(nèi)胚層)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(對(duì)于中胚層)和β-ΙΙΙ微管蛋白(對(duì)于外胚層)的表達(dá)，所有這些蛋白質(zhì)通常都是在這些組織發(fā)育的最早期表達(dá)。此外，基因標(biāo)記物map2、burachyury和gata4都是在胚胎胚層形成的極早期表達(dá)。
[0098]結(jié)果
[0099](i)骨髓源性類孢子細(xì)胞:
[0100]從骨髓分離的類孢子細(xì)胞群在數(shù)天內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞團(tuán)。包含在所述細(xì)胞團(tuán)內(nèi)或單獨(dú)的個(gè)別細(xì)胞表達(dá)以下基因標(biāo)記物，所有這些標(biāo)記物都與胚胎干細(xì)胞相關(guān):0ct4、Nanog、Daxl、Fgf4、Zfp296、Cripto、Gdf3、Utf 1、Cdx2、EcatK Esgl、Sox2 和 Pax6、cMyc (增殖性基因)、Fgf5、01ig2和Pdgfrl2。也觀察到標(biāo)記物巢蛋白(一般與神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物)