集和表征、鑒別或分析富集類孢子細胞的子群的方法。所述富集子群是使用由所述細胞表達的細胞表面或基因表達標(biāo)記物鑒別。如實例中所說明，將細胞培養(yǎng)一段足以表達特定標(biāo)記物的時間，并使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定標(biāo)記物的表達。富集類孢子細胞的群體對例如0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3、UtFl、EcatU EsgU Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-1、CD29、CD34、CD90、BI 整合素、cKit、SP-C, CC10、SFU DAXl和SCGlO等一種或一種以上特定細胞標(biāo)記物呈陽性。在檢測相關(guān)標(biāo)記物之后可使用富集類孢子細胞的群體，這些細胞可進一步培養(yǎng)以促進額外分化，或可從富集的子群進一步分離表達所述標(biāo)記物的細胞。
[0032]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于分離表達相關(guān)蛋白質(zhì)的細胞供進一步增殖的方法。舉例來說，可使用美國專利第7，310，147號中揭露的通過使上千個細胞成像來運作的市售ClonePix FL系統(tǒng)(英國Gentix公司)分離表達相關(guān)標(biāo)記物的細胞。隨后使用特定焚光探針來檢測和鑒別發(fā)熒光的集落。然后，自動收集具有所需熒光度水平的細胞(例如目標(biāo)蛋白質(zhì)的最高制造者)(曼恩(Mann),自然方法(Nature Methods), i_ii, (2007))。這些細胞的球形團連續(xù)傳代產(chǎn)生較純的不成熟且更原始的干細胞群。在其它實施例中，使用細胞表面或基因表達標(biāo)記物分離相關(guān)類孢子細胞子群。在關(guān)于細胞表面標(biāo)記物的一個實施例中，所述方法包括(a)提供如上文所述分離的類孢子細胞群；(b)培養(yǎng)所述類孢子細胞群一段足以表達所述標(biāo)記物的時間；(C)使所述細胞群與標(biāo)記物特異性結(jié)合搭配物在足以使結(jié)合搭配物與其在所述類孢子細胞群每一細胞上可能存在的目標(biāo)結(jié)合的條件下接觸；和(d)分離標(biāo)記物陽性子群。
[0033]在一些實施例中，在上文論述的步驟(C)中，在足以使每一結(jié)合搭配物與其在類孢子細胞群每一細胞上可能存在的目標(biāo)結(jié)合的條件下，細胞與第一標(biāo)記物特異性第一結(jié)合搭配物以及第二標(biāo)記物(不同于第一標(biāo)記物)特異性第二結(jié)合搭配物接觸；(d)選擇對標(biāo)記物呈陽性的第一類孢子細胞子群；(e)使第一類孢子細胞子群與對一種或一種以上其它細胞表面標(biāo)記物具特異性的一種或一種以上其它結(jié)合搭配物在足以使每一結(jié)合搭配物與其在細胞群每一細胞上可能存在的目標(biāo)結(jié)合的條件下接觸；(f)從第一細胞子群取出結(jié)合于步驟(e)的至少一種抗體的細胞；和(g)收集第二細胞子群，由此分離類孢子細胞子群。在一些實施例中，結(jié)合搭配物是細胞表面標(biāo)記物特異性抗體。
[0034]所揭露的子群的分離可使用能根據(jù)一種或一種以上特定標(biāo)記物的表達或表達的缺乏而分離細胞的任何方法(包括(但不限于)熒光活化細胞分選法(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS))進行。標(biāo)記物選自由以下各物組成的群組:0ct4、nanog、Zfp296、cripto、Gdf3、UtFK EcatK EsgK Sox2、Pax6、巢蛋白、SCA-KCD29、CD34、CD90、B1 整合素、cKit、SP-C、CC10、SF1、DAX1、SCG10、SCA-1、CD34、CD90、CKIT、BI整合素。
[0035]分離步驟可按一系列步驟逐步或同時進行。舉例來說，可個別地評估每一標(biāo)記物的存在或不存在，根據(jù)個別標(biāo)記物的存在與否，在每一步驟產(chǎn)生兩個子群。之后，可選出相關(guān)子群，并根據(jù)下一標(biāo)記物的存在或不存在再分。
[0036]或者，可通過只分出具有特定標(biāo)記物概況(marker profile)的細胞來產(chǎn)生子群，其中短語“標(biāo)記物概況”是指關(guān)于兩種或兩種以上標(biāo)記物存在或不存在的概要。這些個別標(biāo)記物組合中每一者都表示一種不同的標(biāo)記物概況。當(dāng)添加其它標(biāo)記物時，這些概況會變得更復(fù)雜，并對應(yīng)于越來越小的初始混合的細胞群的百分含量。在一些實施例中，采用標(biāo)記物特異性抗體來分離和/或純化具有相關(guān)標(biāo)記物概況的類孢子細胞子群，并且應(yīng)了解，根據(jù)相關(guān)標(biāo)記物概況，可使用這些抗體陽性或陰性選擇某一群體的數(shù)個部分，這些部分在一些實施例中接著再分成數(shù)部分。
[0037]在一些實施例中，結(jié)合搭配物標(biāo)記有可檢測標(biāo)記。結(jié)合不同標(biāo)記物的不同結(jié)合搭配物可標(biāo)記有不同可檢測標(biāo)記，或者可采用相同可檢測標(biāo)記。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種可檢測標(biāo)記，以及用于將可檢測標(biāo)記與例如抗體和其片段和/或衍生物等生物分子偶聯(lián)的方法。代表性可檢測部分包括(但不限于)共價連接的發(fā)色團、熒光部分、酶、抗原、具有特異性反應(yīng)性的基團、化學(xué)發(fā)光部分和可以電化學(xué)方式檢測的部分等。在一些實施例中，結(jié)合搭配物經(jīng)生物素化。在一些實施例中，使用包含與熒光標(biāo)記(包括(但不限于)Cy3、Cy5和Cy7)偶聯(lián)的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素基團的第二結(jié)合搭配物來檢測結(jié)合細胞表面上的標(biāo)記物的生物素化結(jié)合搭配物(第一結(jié)合搭配物)。在一些實施例中，結(jié)合搭配物用例如Cy3、Cy5或Cy7等熒光標(biāo)記直接標(biāo)記。在一些實施例中，結(jié)合搭配物用熒光標(biāo)記直接標(biāo)記，且結(jié)合抗體的細胞借助熒光活化細胞分選法分離。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它檢測策略。
[0038]II1.類孢子細胞子群的應(yīng)用
[0039]細胞培養(yǎng)和遺傳操作
[0040]本文中揭露的細胞可直接投予患者；在投予前經(jīng)過誘導(dǎo)而分化成內(nèi)胚層、外胚層或中胚層中任一來源的細胞；或者可遵循遺傳操作使其表達特定因子。舉例來說，可通過用包括編碼這些因子的序列的基因構(gòu)筑體轉(zhuǎn)染類孢子細胞子群，來使其表達激素，例如胰島素。
[0041]類孢子細胞子群的分化
[0042]類孢子細胞子群不管其來源組織如何都可經(jīng)過誘導(dǎo)而分化成來自三種胚層中任一種的細胞，例如皮膚和毛發(fā)細胞，包括上皮細胞、角化細胞、黑素細胞、脂肪細胞；形成骨骼、肌肉和結(jié)締組織的細胞，例如肌細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺泡細胞；實質(zhì)細胞，例如肝細胞、腎細胞、腎上腺細胞和胰島細胞(例如α細胞、δ細胞、PP細胞和β細胞)；血液細胞(例如白細胞、紅細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)；視網(wǎng)膜細胞(和感官知覺中所涉及的其它細胞，例如形成耳中的毛細胞或舌上的味蕾的細胞)；神經(jīng)組織，包括腦和神經(jīng)；和成纖維細胞。
[0043]類孢子細胞子群可經(jīng)過誘導(dǎo)而以多種方式分化。標(biāo)記物陽性類孢子細胞當(dāng)與患者體內(nèi)的組織接觸或與將受組織釋放的物質(zhì)(例如生長因子、酶或激素)影響的所述組織足夠接近時可發(fā)生分化。細胞分化受細胞從周圍組織接收到的信號影響。舉例來說，當(dāng)細胞表面上的受體結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)來自患者體內(nèi)組織所釋放的分子(例如生長因子、酶或激素)的信號時，將發(fā)生此信號傳導(dǎo)?；蛘?，或另外，可通過將某種物質(zhì)(例如生長因子、酶、激素或其它信號傳導(dǎo)分子)添加到細胞環(huán)境中，來誘導(dǎo)本文中揭露的細胞分化。舉例來說，可將某種物質(zhì)添加到含有類孢子細胞子群的培養(yǎng)皿中、添加到適于將細胞施用于組織的網(wǎng)格或其它襯底，或添加到患者體內(nèi)的組織中。當(dāng)全身或局部投予誘導(dǎo)細胞分化的物質(zhì)時，其可根據(jù)藥學(xué)上可接受的方法投予。舉例來說，可在載劑或賦形劑存在或不存在下，以生理學(xué)相容的緩沖液投予蛋白質(zhì)、多肽或寡核苷酸。因此，類孢子細胞子群可在培養(yǎng)物中或在患者體內(nèi)分化，并且可在與固體支撐物接觸或暴露于自然表達、外源投予或因遺傳操作而表達的物質(zhì)后進行分化。
[0044]在一個實施例中，通過將類孢子細胞群暴露于“外胚層分化”培養(yǎng)基來誘導(dǎo)所述細胞分化成外胚層來源的細胞。在另一實施例中，通過將類孢子細胞群暴露于“中胚層分化培養(yǎng)基”來誘導(dǎo)所述細胞分化成中胚層來源的細胞。在又一實施例中，通過將類孢子細胞群暴露于“內(nèi)胚層培養(yǎng)基”來誘導(dǎo)所述細胞分化成內(nèi)胚層來源的細胞。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知“內(nèi)胚層”、“中胚層”和“外胚層”培養(yǎng)基的組分?？墒褂靡阎募毎砻鏄?biāo)記物來驗證細胞確實分化成相應(yīng)細胞培養(yǎng)基譜系的細胞。最普遍認(rèn)可的用以確定三種胚層分化的標(biāo)記物是α胎蛋白(對于內(nèi)胚層細胞)、α平滑肌肌動蛋白(對于中胚層)和β-1II微管蛋白(對于外胚層)的表達，所有這些蛋白質(zhì)通常都是在這些組織發(fā)育的最早期表達。
[0045]不管分化的刺激物如何，足以幫助維持或修復(fù)組織的已經(jīng)分化或?qū)⒁只念愭咦蛹毎尤憾伎赏队杌颊?例如，皮膚燒傷或其它受外傷區(qū)域、骨折、韌帶撕裂、萎縮的肌肉、功能失常的腺體或受神經(jīng)退化過程或自體免疫反應(yīng)不良影響的區(qū)域的部位)。
[0046]腫瘤類孢子細胞
[0047]⑴疫苗治療
[0048]獲得的類孢子細胞子群可為特別有用的研宄工具，并且有可能用于療法中，例如，從胰臟腫瘤分離的類孢子細胞可與樹突狀抗原呈遞細胞一起使用，作為連續(xù)細胞介導(dǎo)的疫苗。
[0049]目前的實驗性樹突狀細胞疫苗使用了很短的一段時間，但最終失敗了，很可能是因為這些疫苗是源自于成熟腫瘤細胞。如果腫瘤細胞的遺傳學(xué)發(fā)生改變，那么疫苗可能會變得無用，類似于每年的病毒流感疫苗所出現(xiàn)的情形。獲得有力進化的腫瘤干細胞應(yīng)能制造出更有效的疫苗。可培養(yǎng)腫瘤源性類孢子細胞群并用于刺激免疫系統(tǒng)細胞攻擊并潛在地治療腫瘤或惡性疾病，如例如廖(Liau)等人，神經(jīng)腫瘤學(xué)雜志(J.0fNeur0.)90(6):1115-24(1999)中所證實。廖等人(1999)證實，可通過實際地分離特定類型腦腫瘤(顱內(nèi)膠質(zhì)瘤)的細胞，并刺激可源自于患者的稱為樹突狀細胞的特定類型免疫細胞，所述免疫細胞接著實際地處理由腫瘤細胞產(chǎn)生的抗原，并由此刺激免疫系統(tǒng)其余部分攻擊實際腦腫瘤，引起腫瘤消退或消失，以此治療腦腫瘤。此攻擊是通過由例如T-8、T-4以及B細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子的產(chǎn)生來介導(dǎo)。這一特殊方法已經(jīng)在治療腦腫瘤的動物和早期人類試驗中顯示出治療益處。這種技術(shù)的一個主要局限性在于，盡管能制造出針對特定類型腫瘤細胞的有效疫苗，但隨時間推移，腫瘤發(fā)生突變，并因此可能產(chǎn)生不會對初始疫苗具反應(yīng)性的新腫瘤。因此，可使用將表達更多種抗原并能持續(xù)保持在培養(yǎng)狀態(tài)的腫瘤源性類孢子細胞代替腫瘤細胞。由于這些類孢子細胞表達抗原并發(fā)生突變，故可以合成最新的疫苗，并用于治療患者的腫瘤復(fù)發(fā)。人們已經(jīng)注意到，在稱為胰島瘤的特定類型腫瘤中存在類孢子細胞。沒有理由預(yù)期無法從所有腫瘤類型分離出類孢子細胞。使用腫瘤源性類孢子細胞刺激疫苗的一個潛在優(yōu)勢在于這樣一個事實:因為類孢子細胞非常原始，所以其具有充分的潛力來表達并分化成多種腫瘤細胞，且表達多種抗原。換句話說，如果使用較為基礎(chǔ)的腫瘤細胞來制造疫苗，那么針對具有較大潛力產(chǎn)生不同類型腫瘤抗原的細胞的免疫反應(yīng)的多樣性將會因腫瘤中發(fā)生的自然突變而最終產(chǎn)生更有效的疫苗。此外，還可能從血液、骨髓和胸腺分離出能夠分化成免疫系統(tǒng)所有細胞類型(包括自然殺傷細胞、Τ-4和Τ-8細胞，以及B或抗體產(chǎn)生細胞)的類孢子細胞。另外，樹突狀細胞(抗原呈遞細胞)可由類孢子細胞進化得到。這將有可能不僅利用各種類型腫瘤細胞，而且利用例如病毒、HIV和細菌(例如炭疽)等微生物在體外刺激免疫系統(tǒng)。這樣可提供一種產(chǎn)生針對腫瘤和例如HIV和炭疽熱等感染性疾病的新疫苗的機制。此外，還可能在體外培養(yǎng)通過活檢從腫瘤得到的類孢子細胞，并且可使用不同治療劑來測試針對體外惡性類孢子細胞的作用，由此預(yù)測治療劑為化療劑、疫苗或輻射時患者的反應(yīng)。就像從病弱的患者分離細菌并通過培養(yǎng)和敏感性測試以選擇有效抗生素治療一樣，從活檢樣品分離腫瘤類孢子細胞將有可能進行腫瘤培養(yǎng)和化療敏感性測試。此外，從患者分離的腫瘤類孢子細胞將適用于不斷演變的分子診斷學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，由此概述出患者腫瘤所需的診斷和治療介入。
[0050](ii)腫瘤細胞的DNA修復(fù)
[0051]活細胞中的D