預期含量時，終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應； b) 向終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶B活性的 蛋白質，使其與溶液中的硫酸皮膚素進行酶解反應；監測酶解過程溶液中硫酸皮膚素的含 量變化，待硫酸皮膚素的含量達到預期含量時，終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應，得到 期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣品溶液。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于： 所述方法A的步驟1)和所述方法B的步驟b)中，所述具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋 白質為硫酸軟骨素酶B或硫酸軟骨素酶B融合蛋白；其中硫酸軟骨素酶B融合蛋白中融合 有硫酸軟骨素酶B和麥芽糖結合蛋白； 所述方法A的步驟2)和所述方法B的步驟a)中，所述具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋 白質為硫酸軟骨素酶AC或硫酸軟骨素酶AC融合蛋白；其中，所述硫酸軟骨素酶AC融合蛋 白中融合有硫酸軟骨素酶AC和麥芽糖結合蛋白。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述硫酸軟骨素酶B融合蛋白的氨基酸 序列是CN103103173A中SEQIDNO:4所示的氨基酸； 所述硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的氨基酸序列是CN103103174A中SEQIDNo:4所示的 氨基酸。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于： 所述方法A的步驟1)中，所述類肝素樣品的溶液和肝素樣品的溶液均由pH7. 4Tris緩 沖液配制而成；所述類肝素樣品的溶液和肝素樣品的溶液的濃度均為10mg/ml-100mg/ml; 所述方法A的步驟1)中，所述酶解反應的反應條件如下：溫度為25-35°C，pH值為 7-8 ； 所述方法A的步驟1)中，通過HPLC法監測酶解過程溶液中硫酸皮膚素的含量變化； 所述方法A的步驟1)中終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應的方法為：將具有硫酸軟 骨素酶B活性的蛋白質滅活，并通過離心使滅活后具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質從所 述溶液中除去；所述滅活的方法為：90-100°C加熱10-15min; 所述方法A的步驟2)中，所述酶解反應的反應條件如下：溫度為25-35°C，pH值為 6-8 ； 所述方法A的步驟2)中，通過HPLC法監測酶解過程溶液中硫酸軟骨素的含量變化； 所述方法A的步驟2)中終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應的方法為：將具有硫酸 軟骨素酶AC活性的蛋白質滅活，并通過離心使滅活后具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質 從所述溶液中除去；所述滅活的方法為：90-100°C加熱10_15min。
5. 根據權利要求4任一項所述的方法，其特征在于：所述方法A還包括下述步驟3)和 / 或 4): 步驟3)為：在步驟2)前對終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應的溶液進行如下處 理：向終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應的溶液中加入乙醇，離心收集沉淀并除去水分， 得到干產物，并將所述干產物配制成溶液；所述干產物配制的溶液的濃度為lOmg/ml~ 100mg/ml，該溶液由pH7. 4Tris緩沖液配制而成； 步驟4)為：對步驟2)中所述期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣 品溶液進行如下處理：向所述期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣品溶 液中加入乙醇，離心收集沉淀并除去水分，得到純化的具有期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚 素含量的類肝素或肝素樣品。
6. 根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于： 所述方法B的步驟a)中，所述類肝素樣品的溶液和肝素樣品的溶液均由pH7. 4Tris緩 沖液配制而成；所述類肝素樣品的溶液和肝素樣品的溶液的濃度均為10mg/ml-100mg/ml; 所述方法B的步驟a)中，所述酶解反應的反應條件如下：溫度為25-35°C，pH值為 6-8 ； 所述方法B的步驟a)中，通過HPLC法監測酶解過程溶液中硫酸軟骨素的含量變化； 所述方法B的步驟a)中終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應的方法為：將具有硫酸 軟骨素酶AC活性的蛋白質滅活，并通過離心使滅活后具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質 從所述溶液中除去；所述滅活的方法為：90-100°C加熱10_15min; 所述方法B的步驟b)中，所述酶解反應的反應條件如下：溫度為25-35°C，pH值為 7-8 ； 所述方法B的步驟b)中，通過HPLC法監測酶解過程溶液中硫酸皮膚素的含量變化； 所述方法B的步驟b)中終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應的方法為：將具有硫酸軟 骨素酶B活性的蛋白質滅活，并通過離心使滅活后具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質從所 述溶液中除去；所述滅活的方法為：90-100°C加熱10_15min。
7. 根據權利要求6任一項所述的方法，其特征在于：所述方法B還包括下述步驟c)和 / 或d): 步驟c)為：在步驟b)前對終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應的溶液進行如下處 理：向終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應的溶液中加入乙醇，離心收集沉淀并除去水 分，得到干產物，并將所述干產物配制成溶液；所述干產物配制的溶液的濃度為lOmg/ml~ 100mg/ml，該溶液由pH7. 4Tris緩沖液配制而成； 步驟d)為：對步驟b)中所述期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣 品溶液進行如下處理：向所述期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣品溶 液中加入乙醇，離心收集沉淀并除去水分，得到純化的具有期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚 素含量的類肝素或肝素樣品。
8. 根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于：所述含類肝素、硫酸軟骨素和 硫酸皮膚素的類肝素樣品為未精制的達納肝素鈉，即硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的含量不符 合歐洲藥典7.O標準的達那肝素鈉樣品。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于： 所述方法A的步驟1)中，所述具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質與類肝素樣品或肝素 樣品的配比為：每千克類肝素樣品或肝素樣品中加入13060-24500IU的具有硫酸軟骨素酶 B活性的蛋白質；酶解的時間為30-45小時； 所述方法A的步驟2)中，所述具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質與類肝素樣品或肝 素樣品的配比為：每千克類肝素樣品或肝素樣品中加入8280-15525IU的具有硫酸軟骨素 酶AC活性的蛋白質；酶解的時間為27-40. 5小時； 所述方法B的步驟a)中，所述具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質與類肝素樣品或肝 素樣品的配比為：每千克類肝素樣品或肝素樣品中加入8280-15525IU的具有硫酸軟骨素 酶AC活性的蛋白質；酶解的時間為27-40. 5小時； 所述方法B的步驟b)中，所述具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質與類肝素樣品或肝素 樣品的配比為：每千克類肝素樣品或肝素樣品中加入13060-24500IU的具有硫酸軟骨素酶 B活性的蛋白質；酶解的時間為30-45小時。
10. 權利要求1-9中任一項所述方法制備得到的類肝素樣品或肝素樣品。
【專利摘要】本發明公開了一種精確定量控制肝素/類肝素中CS及DS含量的方法。該方法步驟如下：1)向含類肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質，待DS含量達到預期值時，終止酶解反應；2)向溶液中繼續加入具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質，待CS含量達到預期值時，終止酶解反應，即得到期望CS及DS含量的肝素樣品或類肝素樣品。本發明實現了對肝素/類肝素中CS、DS含量的高效、精確控制，從而建立新型肝素類產品的低成本、高產率的生產工藝。且該方法簡單易行，具有規模化生產的應用價值，能夠用于生產符合歐洲藥典標準的達那肝素鈉。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號】CN104725532
【申請號】CN201510127522
【發明人】邢新會, 蘇楠, 張翀, 梅祥
【申請人】清華大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月23日