一種精確定量控制肝素/類肝素中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種精確定量控制肝素/類肝素中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的 方法。
【背景技術】
[0002] 1. 1 肝素
[0003] 1. 1. 1肝素簡介：
[0004] 肝素化巧arin，H巧首先從肝臟發現而得名，肝素廣泛分布在哺乳動物的組織 中，如肝、肺、腸系膜、屯、、脾、腎、胸腺、胎盤、肌肉和血液中都有存在（高照明，曹現平，張 玉冰，豬小腸粘膜/漿膜/腸衣中的粘多糖組成分析[J]，化學與生物工程，2012, 29(4); 91-94)。各種組織中肝素的含量與肥大細胞的數目有關，肥大細胞內的顆粒含有肝素或肝 素前體，當物理或化學剌激使肥大細胞脫粒時，肝素被釋放出來，在體內被肝臟產生的肝素 酶滅活而從尿排泄出來炬rinkous K.M, Smith H.P, Warner E.D,et al. The Inhibit ion o f Blood Clotting:an Unidentified Sub-stance which Acts in Conjunction w it h Heparin to Prevent t he Conversion of Prothrombin into ThrombinlJ2. Am. J. Phy siol，1939, 125:683~687.)。肝素具有強抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞 性疾病的首選藥物。隨著研究的深入，人們發現肝素不但有抗凝、抗血栓形成和調整血脂的 作用，還有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學功能煙larles H Best. Pr巧aration of Heparin and Its Use in the First Clinical Cases[J]. Circulation. 1959, 19:79~ 86)。肝素在體內多W與蛋白質結合W糖蛋白復合物的形式存在。該種復合物沒有抗凝血活 性，但在去除蛋白質后，該種抗凝活性逐漸表現出來OJader皿,Lopes C, Rocha Hao, Santos EA, Dietrich CP. Heparins and heparinoids occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activitie[J]. Curr. pHarm. Des. 2004,10 ;951 ~966)。 由于瘋牛病的病原體阮粒是傳染性蛋白質顆粒，為不含有核酸的感染性蛋白因子，其主要 成份是一種蛋白酶抗性蛋白，具有對蛋白酶的抵抗力，易溶于去污劑、有致病力和不誘發抗 體等特性，給患病動物及人類的診斷和防治帶來很大麻煩，給人類和動物的健康和生命帶 來嚴重的威脅，因此從反當動物中提取肝素鋼存在較大的安全性風險，現在藥用肝素鋼主 要從豬小腸黏膜提取化azuy址i Sug址ara, Satoml P'Jadanaka, Kyoko Takeda. Structural analysis of unsaturated hexasaccharides from shark cartilage chondroitin sulfate D that are substrates for the exolytic action of chondroitin sulfate ABC lyase. Elurope of journal biochemistry, 2006, 239:871-880)。
[0005] 肝素鋼的結構異常復雜，是由糖醒酸和葡萄糖胺W 1 - 4鍵連接起來的為主 要重復二糖單位組成的多糖鏈的混合物。其分子量是一個很寬的分布為3000-30000， 平均分子量是12000-15000,含10-30個二糖單位不等，約有4種糖醒酸和10種葡萄糖 胺交替無序排列組成（Rafael B. Erlich, Claudio C.Werneck, Paulo A.S.Mourao,et al.Major glycosaminoglycan species in the developing retina:synthesis tissue distribution and effects upon cell death.Expetimental eye research, 2003, 77:157-165)。肝素鋼結構中的主要單糖是2-0-硫酸-a -L艾杜糖醒酸 及6-0-硫酸-N-硫酸-a -D葡萄糖胺，該兩種糖單元是肝素鋼結構中出現頻率最高的 兩個重復單元，由它們組成的=硫酸二糖的重復單位構成了肝素所謂的"規則區"，是肝 素結構的主要部分，也起到了肝素鋼抗凝血的主要作用（Komazawa H，Saiki I，Igarashi Y, et al.The conjugation of RGDS p巧tide with CM-chitin(4):299-307.)。另外 的含有多種單糖殘基，如a A-艾杜糖醒酸，葡萄糖醒酸，6-0-硫酸-N-己酷- a -D葡 萄糖胺，0 -D-葡萄糖醒酸及3-6-雙-0-硫酸-N-硫酸- a -D葡萄糖胺則W很低的頻 率出現于"非規則區"化irano S, Tanaka Y, Haseqawa M, et al.Effect of sulfated deriva tives of chitosan on some blood coagulant factors[J]. Carbohydr Res, 1985, 137 (3) : 205-215.)。一定數目的6位無硫酸化的葡萄糖胺及2-0-硫酸-a -D葡 萄糖醒酸的存在使得肝素中出現了 10種不同的單糖（4種糖醒酸和6種葡萄糖胺），從而使 得肝素的整個結構變得異常復雜（高寧國，.肝素結構與功能的研究進展[J]，生物工程進 展，1999, 19,（5) ;4-13)。肝素常與其他粘多糖一起被提取出來，可由己糖醒酸a-艾杜糖 醒酸、葡萄糖醒酸）與硫酸氨基葡萄糖分子W-定的比例交替聯結形成具有六糖或八糖單 位的線型鏈狀大分子，其結構單元如下所示（A化ertini R, et al.Qion化oitin-4-Sulfate Protects High Density Lipoprotein against Copper Dependent Oxidation[J]. Archives of Biochemistry and BiopHysis, 1999. 365(1):143-149)；
[0006]
【主權項】
1. 一種定量控制類肝素或肝素樣品中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的方法，分為下述 A和B兩種方法： 方法A包括下述步驟： 1) 向含類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的類肝素樣品的溶液中或含肝素、硫酸軟骨 素和硫酸皮膚素的肝素樣品的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質，使其與類肝 素或肝素樣品中的硫酸皮膚素進行酶解反應，監測酶解過程溶液中硫酸皮膚素的含量變 化，待硫酸皮膚素的含量達到預期含量時，終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應； 2) 向終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶AC活性的 蛋白質，使其與溶液中的硫酸軟骨素進行酶解反應；監測酶解過程溶液中硫酸軟骨素的含 量變化，待硫酸軟骨素的含量達到預期含量時，終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應，得 到期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣品溶液； 方法B包括下述步驟： a) 向含類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的類肝素樣品的溶液中或含肝素、硫酸軟骨 素和硫酸皮膚素的肝素樣品的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質，使其與類 肝素或肝素樣品中的硫酸軟骨素進行酶解反應；監測酶解過程溶液中硫酸軟骨素的含量變 化，待硫酸軟骨素的含量達到