菌LSI產[ALeu3]Surfactin抗菌脂膚化學結構式及SU計actin 抗菌脂膚標樣化學結構
[002引 A.枯草芽抱桿菌LSI產[ALeu3]Surfactin抗菌脂膚化學結構式；B.sirfactin 抗菌脂膚標樣化學結構式
[0029] 圖4PKS2質粒誘導敲除流程；
[0030] 其中，中方框為上游序列；黑白相間方框為下游序列；Kan指Kan抗性基因、ItepA 指RepA溫敏復制子基因。
[0031] 圖5刪除D-Leu模塊后的SU計actinA上游、下游片段擴增結果
[0032] 其中，1號泳道是刪除D-Leu模塊的SU計actinA上游片段，2號泳道是刪除D-Leu 模塊的SU計actinA下游片段
[0033] 圖6重疊PCR連接產物擴增結果圖
[0034] 其中，1泳道是重疊PCR連接產物
[003引圖7PMD-19T-ALeu重組載體轉化大腸桿菌陽性克隆子PCR擴增結果圖
[0036] 1、2號泳道是PMD-19T-ALeu載體轉化大腸桿菌菌液PCR陽性克隆子1、2。
[0037] 圖8對地S2-srfA-A-ALeu進行雙酶切驗證結果
[0038] 圖9在LB平板、Kan抗性平板、Erm抗性平板上對敲除株篩選
[0039] 圖10對刪除D-Leu模塊的SU計actinA敲除株進行PCR電泳驗證結果
[0040] 1號泳道是為上下游連接序列；2號泳道是地S2質粒驗證
[0041] 圖11產脂膚的發酵培養產物的高效液相色譜分析
[0042]A、枯草芽抱桿菌PB2-L1菌株發酵產物的液相分析結果
[0043]B、敲除株枯草芽抱桿菌LS1發酵產物的液相分析結果
[0044] 圖12溶血性鑒定
[0045] 1、加入[ALeu3]Surfactin的濾紙板；2、加入su;rfactin的濾紙板；3、加入甲醇 的濾紙板
[004引圖13新型抗菌脂膚[ALeu3]Su;rfactin的抗菌譜
[0047] 1、加入[ALeu3]Surfactin的濾紙板；2、加入su;rfactin的濾紙板；3、加入甲醇 的濾紙板
[0048]A圖為新型抗菌脂膚對短小芽抱桿菌抑菌效果
[0049] B圖為新型抗菌脂膚對對藤黃微球菌抑菌效果
【具體實施方式】
[0050] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件，實施例中涉及的菌株均屬于 現有技術，本領域的技術人員可w很容易地從公開是商業渠道獲得。
[00川 實施例1
[0052] 新型抗菌活性枯草芽抱桿菌化subtilis)LSI敲除載體的構建和敲除株的篩選 與鑒定
[0053] 1.引物設計與合成
[0054] 針對NCBI上關于枯草芽抱桿菌SU計actinA-A亞基公布的基因序列和溫敏載體 地S2質粒的多克隆位點，利用PrimerPremier5軟件進行引物設計，由生工（上海）生物 技術公司合成。引物序列如表1所示；其中，粗體斜體表示酶切位點，下劃線表示引物融合 PCR重疊區域。
[00巧]其中引物5 'srfA-A-ALeu〇(pnI) -F中含有地S2載體上的化nI酶切位點，GGTACC，引物 3'srfA-A-ALeuOOioI)-R含有化0I酶切位點CTCGAG。
[0056] 表1本試驗所用引物
[0057]
【主權項】
1. 一種抗菌脂肽，其特征在于：該抗菌脂肽由P-羥基脂肪酸鏈與L型谷氨酸、L型亮 氨酸、L型纈氨酸、L型天冬氨酸、D型亮氨酸、L型亮氨酸線性排列并環化形成的新型抗菌 脂肽，是一系列環形抗菌脂肽類化合物的總稱，命名為[ALeu3]Surfactin;共有3種組分， 分別為：包括C13P-羥基脂肪酸鏈的抗菌脂肽類化合物1、C14P-羥基脂肪酸鏈的抗菌脂 肽類化合物2、C15 3 -羥基脂肪酸鏈的抗菌脂肽類化合物3 ;經過液相色譜-傅里葉變換離 子回旋共振高分辨質譜LC-FTICR-MS鑒定，化合物1、2、3的分子量分別為909、923、937Da。
2. 產權利要求1所述抗菌脂肽的工程菌的制備方法，其特征在于：該方法將目的 基因D-Leu模塊刪除后的surfactinA上下游序列與pKS2載體連接，獲得重組載體 pKS2-srfA_A- A Leu ;以重組載體pKS2-srfA_A- A Leu轉化枯草芽孢桿菌PB2-L1，通過 PKS2質粒誘導敲除、篩選，獲得產[A Leu3]Surfactin的工程菌枯草芽孢桿菌LSl菌株。
3. 權利要求2所述的抗菌脂肽工程菌的制備方法，其特征在于：目的基因D-Leu模 塊刪除后的surfactinA上下游序列具體獲得步驟如下（1)以枯草芽孢桿菌PB2-L1菌 株總DNA為模板，引物對 5 'srfA-A-ALeu-up-F和 3 'srfA-A-ALeu-up-R進行上 游片段PCR擴增，5 'srfA-A-ALeu-down-F和 3 'srfA-A-ALeu-down-R進行下游 片段PCR擴增；其中，5 'srfA-A-ALeu-up-F序列為：5 ' -CAAGATACGTATCCT-3 '、 AsrfA-A-ALeu-up-R序列為：5 ' -AGTCGGAAGCGTCAG-3 ' ;5，srfA-A-ALeu-down-F 序列為 5 ' -CAGGAGGGAATGCTG-3 ' 、3 'srfA-A-ALeu-down-R序列為 5' -CCACTTGATGTAATC-3'； (2) 以步驟1)獲得的上游和下游片段為模板、上下游連接序列引物： 5 'srfA-A-ALeu(KpnI)-F和 3 'srfA-A-ALeu(XhoI)-R進行重疊PCR，獲 得D-Leu模塊刪除后的surfactinA上下游序列連接產物即重疊PCR連接產物；其 中，5 'srfA-A-ALeu(KpnI)-F的序列如 5 ' -GGTACCCAAGATACGTATCCT-3 '所示， 3 'srfA-A-ALeu(XhoI)-R的序列如 5 ' -CTCGAGCCACTTGATGTAATC-3'所示； (3)將獲得的重疊PCR連接產物與質粒PMD-19T重組，獲得重組質粒PMD-19T- A Leu ; (4) 以KpnI和XhoI雙酶切重組質粒PMD-19T-AAsp獲得目的基因D-Leu模塊刪除 后的surfactinA上下游序列。
4. 權利要求2所述的抗菌脂肽工程菌的制備方法，其特征在于，PKS2質粒誘導敲除、篩 選過程為：將轉化了重組載體pKS2-srfA-A-ALeu的枯草芽孢桿菌PB2-L1單克隆接種到 LB液體培養基中，37 °C下轉接3代后，培養過夜，涂布5mg/L卡那霉素濃度的Kan平板并置 于37°C下培養，轉接3代后，長出的枯草芽孢桿菌單菌落即為發生同源重組單交換的轉化 子；轉接重組單交換的轉化子到LB中，30°C下培養36h后，涂布到LB平板，置于37°C下培 養12h后隨機挑取平板中3000個單菌落接種于Kan平板，選擇Kan平板上不生長的對應的 在LB平板上生長的單菌落就是疑似枯草芽孢桿菌敲除株。
5. 權利要求4所述的抗菌脂肽工程菌的制備方法，其特征在于：對疑似枯草芽 孢桿菌進行PCR進一步鑒定獲得枯草芽孢桿菌敲除株，其過程為：以疑似枯草芽孢桿 菌敲除株單菌落總DNA為模板，上下游連接序列引物5 'srfA-A-ALeu(KpnI) -F和 3'srfA-A-ALeu(XhoI)-R引物、pKS2 質粒驗證引物PKS-1058-ERM-F和PKS-1058-ERM-R 進行PCR鑒定，如果擴增出1107bp條帶，說明上下游連接序列已經成功導入到枯草芽孢桿 菌基因組中，枯草芽孢桿菌敲除株LSl成功獲得。
6. 根據權利要求2-5任一項所述方法制備的工程菌產抗菌脂肽[ALeu3]Surfactin 的生產方法，其特征在于，包括如下步驟：將枯草芽孢桿菌LSl活化，制成濃度為IO7~ IO8Cfu/!的種子液；將枯草芽孢桿菌LSl種子液以5 %濃度接種于Landy發酵培養基中，在 30°C和150rpm條件下培養72h，得到抗菌物質[ALeu3]Surfactin發酵液。
7. 權利要求6所述的抗菌脂肽的生產方法，其特征在于：將上述抗菌物質發酵液在 5000r/min下離心25min除去菌體，上清液調pH至2. 0,低溫4°C過夜，5000r/min離心20min 取沉淀，用甲醇溶解，調節pH至7. 0,于磁力攪拌器上4°C低溫攪拌5h，lOOOOr/min離心 20min后得到的上清液即為[ALeu3]Surfactin粗提物。
8. 權利要求7所述的抗菌脂肽的生產方法，其特征在于，種子液制備過程是：將枯草芽 孢桿菌LSl接種于試管斜面營養瓊脂培養基上，30°C培養24h，將菌種活化；再將試管斜面 活化的枯草芽孢桿菌LSl菌種接種于LB液體培養基，30°C、180rpm培養20~24h，至對數 生長期，制成濃度為IO7~IO8Cfu/!的種子液。
9. 權利要求8所述的抗菌脂肽的生產方法，其特征在于，將[ALeu3]Surfactin粗提 物進一步進行純化，過程為：將[ALeu3]Surfactin粗提物采用RP-C18柱進行HPLC分離純 化；洗脫液為含3.Smmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，洗脫柱為4. 6mm〇X250mm;梯度洗脫條 件為：〇~lOmin，60%體積B相、40%體積A相；10~20min，93%體積B相、7%體積A相； 流速為0. 83ml/min;檢測波長為210nm;HPLC洗脫保留時間為16~17min，獲得純化抗菌脂 肽[ALeu3]Surfactin;其中，B相為3. 8mmol三氟乙酸的乙腈溶液，A相為含3. 8mmol三 氟乙酸的水。
10. 權利要求1所述的抗菌脂肽在食品防腐、動物飼料添加劑、農產品儲藏、農藥生產 方面的應用。
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵生產領域，提供一種新型抗菌脂肽，命名為[ΔLeu3]Surfactin，共有3種組分，包括C13的抗菌脂肽類化合物1、包括C14的抗菌脂肽類化合物2、包括C15的抗菌脂肽類化合物3，分子量分別為909、923、937Da。本發明還提供產該抗菌脂肽工程菌枯草芽孢桿菌LS1菌株的構建方法及該抗菌脂肽的制備過程和應用。[ΔLeu3]Surfactin是一種新型surfactin類抗菌脂肽，相比于surfactin其具有較弱的溶血活性，但對短小芽孢桿菌、藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌都有抑制作用，能夠防治多種植物病害，其毒性較低，在生物防治、食品加工和農產品貯藏保鮮等方面具有應用潛力。
【IPC分類】C12P21-02, C12N15-31, C12R1-125, C12N15-75, C07K7-06
【公開號】CN104725477
【申請號】CN201510150563
【發明人】別小妹, 姜健, 陸兆新, 張充
【申請人】南京農業大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月31日