]Surfactin、制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵生產領域，涉及一種新型抗菌脂膚，命名為[ALeu3] Sudactin，同時，本發明還涉及產該抗菌脂膚工程菌枯草芽抱桿菌LSI菌株的構建方法及 該抗菌脂膚的制備過程和應用。
【背景技術】
[0002] 隨著檢測技術的進步W及環保意識的提高，食品的微生物污染，植物病蟲害，日益 嚴重的致病菌抗藥性與化學藥劑的潛在危害之間的矛盾越來越突出，選擇低毒、高效、選擇 性強、殘留時間短、對環境污染小的微生物天然防腐劑和生防試劑成為當前研究的熱點。細 菌又作為自然界中分布最廣泛的一類微生物，W其繁殖速度快、適應能力強、易于人工培養 等優勢，倍受微生物工作者越來越多的關注。從微生物中提取抗菌物質成本低、周期短、操 作簡單方便、容易實現工業化生產，而且微生物分泌的抗菌物質抑菌譜較寬，熱穩定性較 好，適用抑范圍廣，使用過程不易產生抗性菌和交叉枯抗性，因此可W發揮更大的工業應 用價值。
[0003]Surfacfin家族的脂膚類化合物是由含有走個氨基酸的膚鏈與目-羥基脂肪酸鏈 (通常C13-C16)交聯形成的內醋環狀結構。該家族成員包括表面活性素SU計actin、地衣 芽胞桿菌素lichenyishin、表面活性劑pumilacidin、埃斯波素esperin，其中地衣芽胞桿 菌素pumilacidin和埃斯波素esperin主要應用于制藥工業和環境治理方面。到目前為止 表面活性素SU計actin是研究的最多的SU計actin家族的化合物，其典型結構為一個具有 LLDLLDL的手性親水走膚通過內醋鍵與親油的脂肪酸鏈碳原子的目-羥基相連，親水的氨 基酸在1、3、4、6、7位，而第1位和第5位分別為GliuAsp兩個酸性氨基酸，使SU計actin分 子帶兩個負電荷。
[0004] 通過之前Mohamed A. Mar址iel教授等人的研究，通過敲除其中的一個模塊，在 線性排列的基因簇中，刪除腺巧醜化結構域A-，或者琉基化結構域PCP-，或者縮合結構域 C-結構域，或者修飾結構域，就會產生少一個氨基酸的抗菌脂膚，從而篩選新型抗菌脂膚的 方法，為W后新型抗菌脂膚的開發進行鋪墊并提供技術手段。由于缺少了一個氨基酸的抗 菌脂膚對應的合成酶是已經刪除了大片段基因的，通過基因技術的改造，改造后的合成酶 空間結構發生了比較大的變化，從而影響到合成酶的活性，使得新型抗菌脂膚的產量很低， 該是急需解決的問題。
【發明內容】
[0005] 本發明通過大量試驗，經過地S2質粒無痕敲除方法產生新型抗菌脂膚突變株從 而產生一種新型抗菌脂膚，填補目前研究的空白。
[0006] 1、本發明提供一種抗菌脂膚，該抗菌脂膚由目-羥基脂肪酸鏈與L型谷氨酸、L型 亮氨酸、L型額氨酸、L型天冬氨酸、D型亮氨酸、L型亮氨酸線性排列并環化形成的新型抗菌 脂膚，是一系列環形抗菌脂膚類化合物的總稱，命名為[ALeu3]Surfactin;共有3種組分， 分別為：包括C13目-羥基脂肪酸鏈的抗菌脂膚類化合物1、C14目-羥基脂肪酸鏈的抗菌脂 膚類化合物2、C15目-羥基脂肪酸鏈的抗菌脂膚類化合物3 ;經過液相色譜-傅里葉變換離 子回旋共振高分辨質譜LC-FTICR-MS鑒定，化合物1、2、3的分子量分別為909、923、937Da。
[0007] 2、本發明還提供產上述1抗菌脂膚的工程菌的制備方法，該方法將目的 基因D-Leu模塊刪除后的SU計actinA上下序列與地S2載體連接，獲得重組載體 pKS2-srfA-A-ALeu;W重組載體地S2-srfA-A-ALeu轉化枯草芽抱桿菌PB2-L1，通過 PKS2質粒誘導敲除、篩選，獲得產[ALeu3]Surfactin的工程菌枯草芽抱桿菌LSI菌株。
[0008] 3.上述2提供的抗菌脂膚工程菌的制備方法，其中，目的基因D-Leu模塊刪 除后的SU計actinA上下游序列具體獲得步驟如下（1)W枯草芽抱桿菌PB2-L1菌株 總DNA為模板，引物對 5 'srfA-A-ALeu-up-F和 3 'srfA-A-ALeu-up-R進行上 游片段PCR擴增，5 'srfA-A-ALeu-down-F和 3 'srfA-A-ALeu-down-R進行下游 片段PCR擴增；其中，5 'srfA-A-ALeu-up-F序列為；5 ' -CAAGATACGTATCCT-3 '、 3'srfA-A-ALeu-up-R序列為；5' -AGTCGGAAGCGTCAG-3' ; 5'srfA-A-ALeu-down-F 序列為 5 ' -CAGGAGGGAATGCTG-3 ' 、3 'srfA-A-ALeu-down-R序列為 5' -CCACTTGATGTAATC-3^ ;
[0009] 0)W步驟1)獲得的上游和下游片段為模板、上下游連接序列引物： 5 'srfA-A-ALeu(KpnI)-F和 3 'srfA-A-ALeu〇(hol)-R進行重疊PCR，獲 得D-Leu模塊刪除后的su計actinA上下游序列連接產物即重疊PCR連接產物；其 中，5 'srfA-A-ALeu(KpnI)-F的序列如 5 ' -GGTACCCAAGATACGTATCCT-3 '所示， 3'srfA-A-ALeu狂hoi)-R的序列如 5' -CTCGAGCCACTTGATGTAATC-3'所示；
[0010] 做將獲得的重疊PCR連接產物與質粒PMD-19T重組，獲得重組質粒 PMD-19T-ALeu；
[001U(4)W化nI和化oI雙酶切重組質粒PMD-19T-AAsp獲得目的基因D-Leu模塊 刪除后的su計actinA上下游序列。
[001引 4、上述2提供的抗菌脂膚工程菌的制備方法，其中，PKS2質粒誘導敲除、篩選過程 為；將轉化了重組載體地S2-srfA-A-ALeu的枯草芽抱桿菌PB2-L1單克隆接種到LB液體 培養基中，37C下轉接3代后，培養過夜，涂布5mg/L卡那霉素濃度的Kan平板并置于37C 下培養，轉接3代后，長出的枯草芽抱桿菌單菌落即為發生同源重組單交換的轉化子；轉接 重組單交換的轉化子到LB中，3(TC下培養3化后，涂布到LB平板，置于37C下培養1化后 隨機挑取平板中3000個單菌落接種于Kan平板，選擇Kan平板上不生長的對應的在LB平 板上生長的單菌落就是疑似枯草芽抱桿菌敲除株。
[0013] 5、上述4提供的抗菌脂膚工程菌的制備方法，其中，對疑似枯草芽抱桿菌進行PCR 進一步鑒定獲得枯草芽抱桿菌敲除株，其過程為；W疑似枯草芽抱桿菌敲除株單菌落總DNA 為模板，上下游連接序列引物 5'srfA-A-ALeu(KpnI)-F和 3'srfA-A-ALeu〇(hol)-R 引物、地S2質粒驗證引物PKS-1058-ERM-F和PKS-1058-ERM-R進行PCR鑒定，如果擴增出 1107bp條帶，說明上下游連接序列已經成功導入到枯草芽抱桿菌基因組中，枯草芽抱桿菌 敲除株成功獲得。
[0014] 6、本發明還提供根據上述2-5任一項方法制備的工程菌產抗菌脂膚[ALeu3] Surfactin的生產方法，包括如下步驟：將枯草芽抱桿菌LSI活化，制成濃度為lO7~ 108c化/I的種子液；將枯草芽抱桿菌LSI種子液W5%濃度接種于Landy發酵培養基中，在 30°C和150巧m條件下培養72h，得到抗菌物質[ALeu3]Surfactin發酵液。
[0015] 7、上述6提供的抗菌脂膚的生產方法，其中，將上述抗菌物質發酵液在5000r/min 下離也25min除去菌體，上清液調抑至2. 0,低溫4°C過夜，500化/min離也20min取沉淀， 用甲醇溶解，調節抑至7. 0,于磁力攬拌器上4C低溫攬拌化，lOOOOr/min離也20min后得 到的上清液即為[ALeu3]Surfactin粗提物。
[001引8、上述7提供的抗菌脂膚的生產方法，其中，種子液制備過程是：將枯草芽抱桿菌LSI接種于試管斜面營養瓊脂培養基上，3(TC培養2化，將菌種活化；再將試管斜面活化的 枯草芽抱桿菌LSI菌種接種于LB液體培養基，3(TC、180巧m培養20~2化，至對數生長期， 制成濃度為107~10 的種子液。
[0017] 9、上述8提供的抗菌脂膚的生產方法，其中，將[ALeu3]Surfactin粗提物進一 步進行純化，過程為：將[ALeu3]Surfactin粗提物采用RP-Cis柱進行HPLC分離純化；洗 脫液為含3. 8mmolH氣己酸的水和己膳溶液，洗脫柱為4. 6mm〇X250mm;梯度洗脫條件為： 0~lOmin，60%體積B相、40%體積A相；10~20min，93%體積B相、7%體積A相；流速 為0. 83ml/min;檢測波長為210皿;HPLC洗脫保留時間為16~17min，獲得純化抗菌脂膚 [ALeu3]Surfactin;其中，B相為3. 8mmolH氣己酸的己膳溶液，A相為含3. 8mmolH氣己 酸的水。
[001引10本發明還提供上述1提供的抗菌脂膚在食品防腐、動物飼料添加劑、農產品儲 藏、農藥生產方面的應用。
[0019] 有益效果：
[0020] 1.研究表明，[ALeu3]Surfactin是一種新型surfactin類抗菌脂jj太，相比于 surfactin其具有較弱的溶血活性，說明該脂膚的毒性與SU計actin比較來說較小，可W為 W后作為食品添加劑成為可能。并且，對短小芽抱桿菌、蠟樣芽抱桿菌、藤黃微球菌都有抑 制作用，能夠防治多種植物病害。在世界范圍內還沒有報道，可W在生物防治、食品加工和 農產品膽藏保鮮等方面非常具有應用潛。
[0021] 2. [ A Leu3] Surfactin是第一次通過分子技術手段成功改造缺少了第H位D型亮 氨酸的抗菌脂膚，前人并沒有該物質的報道。此次構建缺少了第H位D型亮氨酸的抗菌脂 膚的分子克隆技術是運用了溫敏型載體無痕敲除技術，大大縮短了敲除的時間；并且由于 此技術并沒有外源污染抗性基因在改造菌株中的殘留，從而為改造后的菌株在食品產業中 的應用提供了保障。
[002引 3.本發明提供的抗菌脂膚[A Leu3]Su計actin的制備方法相較于現有技術具有 發酵時間短，發酵產物易于分離純化，從而為新型抗菌抗菌脂膚的鑒定提供了基礎。
[0023] 4.本發明采用的B. subtilis是被美國環保署列為可商業上應用的微生物菌種之 一，我國農業部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種，并在農業領域已得到廣泛的應用。枯 草芽抱桿菌LSI抗菌脂膚[A Leu3] Surfactin抗菌脂膚屬于人工改造微生物天然抗菌膚， 對人類健康和食品安全性高，不會導致對環境的污染，可用于生物防治、食品加工和農產品 膽藏保鮮等。
【附圖說明】
[0024]圖1枯草要抱桿菌LSI產[ALeu3]Surfactin抗菌脂膚W及su計actin抗菌脂 膚標樣的ESI-MS圖
[00巧]A圖是新型抗菌脂膚[ALeu3]Surfactin的一級質譜的鑒定；B圖是SU計actin抗 菌脂膚標樣的一級質譜
[0026] 圖2枯草芽抱桿菌S1產[ALeu3]Surfactin抗菌脂膚-H2〇m/z905. 5668離子碎 片分析圖
[0027] 圖3枯草芽抱桿