連接 產物加入50μ LE. coli Trans Tl感受態細胞，混勻，冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴3min， 加入900 μ L LB液體培養基，置于37°C，200r/min震蕩培養lh，4000r/min離心lmin，棄掉 800 μ L上清，將剩余的培養液混合均勻后涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，置于37°C溫箱 中培養12~14h ;挑取單菌落接種于3mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養9~12h，利 用質粒提取試劑盒提取重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-pl、pEASY-Blunt-simple-p2、 pEASY-Blunt_simple-p3,置于 _20°C保存備用； (4) 重組克隆質粒的鑒定 以提取的重組克隆質粒 pEASY-Blunt-simple-pl、pEASY-Blunt_simple-p2、 pEASY-Blunt-simple-p3為模板，以fPl為上游引物，rPl為下游引物，PCR擴增重組克 隆質粒pEASY-Blunt-simple-pl ;以fP2為上游引物，rP2為下游引物，PCR擴增重組克 隆質粒pEASY-Blunt-simple-p2 ;以fP3為上游引物，rP3為下游引物，PCR擴增重組克 隆質粒pEASY-Blunt-simple-p3 ;PCR反應體系總體積為50 μ L，包括2 μ L模板，2 μ L濃 度為lOymol/L的上游引物，2yL濃度為lOymol/L的下游引物，IOyL 5XTransStart FastPfu Buffer，5 μ L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 μ L 高保真的 FastPfu DNA聚合酶，28 μ L ddH20, PCR擴增重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-pl的PCR反應條 件為：95°C預變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s，30次循環，72°C延伸 IOmin ;PCR擴增重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p2的PCR反應條件為：95°C預變性 311^11，941：變性3〇8,621：退火3〇8,721：延伸4〇8,30次循環，721：延伸1〇1^11屮0?擴增重 組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p3的PCR反應條件為：95°C預變性3min，94°C變性30s， 60°C退火 30s，72°C 延伸 40s，30 次循環，72°C 延伸 IOmin ; 以重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-pl為模板，PCR擴增獲得大小為1203bp的目的 條帶；以重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p2為模板，PCR擴增獲得大小為IllObp的目 的條帶；以重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p3為模板，PCR擴增獲得大小為1182bp的 目的條帶，均與預期大小相符； 將PCR鑒定為陽性的重組克隆質粒用限制性內切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定， 雙酶切反應體系總體積為50 μ L，包括5 μ L 10 Xbuffer，8 μ L陽性重組克隆質粒，1 μ L限 制性內切酶EcoR I，lyL限制性內切酶Xho I，35yL ddH20,37°C水浴30min，電泳觀察酶 切片段的大小：陽性重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-pl經酶切后，獲得大小為3830bp 和1203bp的目的條帶；陽性重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p2經酶切后，獲得大小為 3830bp和IllObp的目的條帶；陽性重組克隆質粒pEASY-Blunt-simple-p3經酶切后，獲得 大小為3830bp和1182bp的目的條帶，均與預期大小相符； 膠回收經過雙酶切的基因片段Pl、p2、p3,對雙酶切鑒定正確的陽性重組克隆 質粒進行測序，將測序結果與序列表中的SEQ ID NO:6進行比對，確認重組克隆質粒 pEASY-Blunt-simple-pl、pEASY-Blunt-simple-p2、pEASY-Blunt_simple-p3 中的基因片段 pl、p2、p3序列正確； (5) 重組表達質粒的構建 原核表達載體pET-28a(+)和原核表達載體pET-32a(+)首先經限制性內切酶EcoR I 和Xho I雙酶切，雙酶切反應體系總體積為50 μ L，包括5 μ L 10 Xbuffer，8 μ L陽性重組克 隆質粒，IyL限制性內切酶EcoR Ι，1μ L限制性內切酶Xho I，35 μ L ddH20,然后將上述經 限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切的基因片段pi與經限制性內切酶EcoR I和Xho I 雙酶切的原核表達載體pET-28a(+)連接，經限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切的基因 片段p2、p3與經限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切的原核表達載體pET-32a(+)連接， 連接體系為：1以1^原核表達載體，2以1^10\131^61'，1以1^了40嫩連接酶，16以1^基因片段， 置于16°C下連接過夜；將10 μ L連接產物加入100 μ LE. coli Trans Tl感受態細胞，混勻， 冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴3min，加入900 μ L LB液體培養基，置于37°C，200r/min震 蕩培養lh，4000r/min離心lmin，棄掉800 μ L上清，將剩余的培養液混合均勻后涂布于含 相應抗生素的LB平板，置于37°C溫箱中培養12~14h ;挑取單菌落接種于3mL含相應抗生 素的LB液體培養基中培養9~12h，利用質粒提取試劑盒提取重組表達質粒pET-28a-pl、 pET-32a-p2、pET-32a-p3,置于-20°C保存備用； (6) 重組表達質粒的鑒定 以提取的重組表達質粒pET-28a-pl、pET-32a-p2、pET-32a-p3為模板，利用三對引物 fPl/rPl、fP2/rP2、fP3/rP3 分別擴增重組表達質粒 pET-28a-pl、pET-32a-p2、pET-32a-p3 : 以fPl為上游引物，rPl為下游引物，PCR擴增重組表達質粒pET-28a-pl ;以fP2為上游引 物，rP2為下游引物，PCR擴增重組表達質粒pET-32a-p2 ;以fP3為上游引物，rP3為下游引 物，PCR擴增重組表達質粒pET-32a-p3 ;PCR反應體系總體積為50 μ L，包括2 μ L模板，2 μ L 濃度為10以111〇1/1的上游引物，2 4 1^濃度為1(^111〇1/1的下游引物，1(^1^5\1^1^5七&竹 FastPfu Buffer，5 μ L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 μ L 高保真的 FastPfu DNA聚合酶，28 μ L ddH20，PCR擴增重組表達質粒pET-28a-pl的PCR反應條件為：95°C預變 性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s，30次循環，72°C延伸IOmin ;PCR擴增重 組表達質粒pET-32a-p2的PCR反應條件為：95°C預變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s， 72°C延伸40s，30次循環，72°C延伸IOmin ;PCR擴增重組表達質粒pET-32a-p3的PCR反應 條件為：95°C預變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s，30次循環，72°C延伸 IOmin ； 以重組表達質粒pET-28a-pl為模板，PCR擴增獲得大小為1203bp的目的條帶；以重 組表達質粒pET-32a-p2為模板，PCR擴增獲得大小為IllObp的目的條帶；以重組表達質粒 pET-32a-p3為模板，PCR擴增獲得大小為1182bp的目的條帶，均與預期大小相符； 將PCR鑒定為陽性的重組表達質粒用限制性內切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定， 雙酶切反應體系總體積為50 μ L，包括5 μ L 10 Xbuffer，8 μ L陽性重組克隆質粒，1 μ L限 制性內切酶EcoR I，lyL限制性內切酶Xho I，35yL ddH20,37°C水浴30min，電泳觀察酶 切片段的大小：陽性重組表達質粒pET-28a-pl經酶切后，獲得大小為5369bp和1203bp的 目的條帶；陽性重組表達質粒pET-32a-p2經酶切后，獲得大小為5900bp和IllObp的目的 條帶；陽性重組表達質粒pET-32a-p3經酶切后，獲得大小為5900bp和1182bp的目的條帶， 均與預期大小相符； 膠回收經過雙酶切的基因片段pl、p2、p3,對雙酶切鑒定正確的陽性重組表達質粒進 行測序，將測序結果與序列表中的SEQ ID N0:6進行比對，確認重組表達質粒pET-28a-pl、 pET-32a-p2、pET-32a-p3 中基因片段 pl、p2、p3 序列正確； 步驟四、壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白的表達與純化 (1) 壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白的表達 將步驟三中鑒定正確的重組表達質粒pET-28a-pl、pET-32a-p2、pET-32a-p3分別轉化 E. coli BL21 (DE3)pLysS感受態細胞，挑取單菌落接種于3ml含相應抗生素的LB液體培養 基中，置于37°C，200r/min震蕩培養過夜；取2ml經過夜培養的菌液，接種于200ml含相應 抗生素的LB液體培養基中，置于37°C，200r/min震蕩培養至0D600為0. 5~0. 8時，分別加 入終濃度為 lmm〇l/L、0. 2mmol/L、0. 2mmol/L 的 IPTG，繼續震蕩培養 6h，4°C下、12000r/min 離心10min收集菌體；進行SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況，在聚丙烯酰氨凝膠上觀察 到相對分子質量為48ku、59ku、62ku的目的條帶，與預期大小相符； (2) 壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白的純化 采用蒸餾水清洗泵清洗Ni柱，流速為25ml/min ;采用結合緩沖液平衡柱子，流速為 lml/min ;將含有上述重組蛋白pET-28a-Pl、pET-32a-P2、pET-32a-P3的樣品分別上柱，流 速為lml/min ;采用5ml結合緩沖液洗漆，流速為lml/min ;采用洗脫緩沖液線性洗脫Ni柱， 流速為lml/min ;固定體積收集；取少量收集液，進行SDS-PAGE分析重組蛋白pET-28a-Pl、 pET-32a-P2、pET-32a-P3 的純度； 將經Ni柱純化后的重組蛋白pET-28a-Pl、pET-32a-P2、pET-32a-P3分別進行 SDS-PAGE，結果表明重組蛋白pET-28a-Pl、pET-32a-P2、pET-32a-P3均已經得到純化，純度 約為90% ;利用BCA微定量法測得重組蛋白pET-28a-Pl、pET-32a-P2、pET-32a-P3的濃度 分別為 〇· 98mg/ml、4. 02mg/ml、2. 51mg/ml。
【專利摘要】壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白及其制備方法，涉及基因工程技術領域，填補了壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白的空白。本發明提供的壞死梭桿菌重組血凝素相關外膜蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示。本發明首先通過染色體步移方法獲得壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因完整核苷酸序列，在此基礎上通過基因工程方法獲得重組的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白，為后續相關實驗提供基礎。本發明采用原核表達系統，應用范圍廣，成本低廉，表達量高，研究背景清晰，技術路線成熟，并且有多種商業化的原核表達載體和表達宿主可供選擇。
【IPC分類】C07K14-33, C12R1-145, C12N15-10, C12N15-70, C12N15-31, C07K1-22
【公開號】CN104673805
【申請號】CN201510055416
【發明人】陳立志, 吳洪超, 馮二凱, 劉曉穎, 彭風華, 程世鵬, 閆喜軍, 吳威
【申請人】中國農業科學院特產研究所, 吉林特研生物技術有限責任公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月3日