CGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'， SP2 :5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3' ， SP3 :5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3' ， SP4 :5,-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3,， SP5 :5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3' ， SP6 :5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3' ； (2) 以FN(AB)的基因組DNA為模板，Genome Walking kit中的簡并引物API、AP2、 AP3、AP4分別為上游引物，SPl為第一輪PCR的下游引物，SP2為第二輪PCR的下游引物， SP3為第三輪PCR的下游引物，經過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5' 端未知序列，第一輪PCR擴增的反應體系總體積為50 μ L，包括1 μ L FN(AB)的基因組DNA， 8 μ L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 μ L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 〇. 5 μ L濃度為5U/ μ L的LA Taq，1 μ L濃度為IOOpmo/ μ L的上游引物，1 μ L濃度為IOpmo/ μ L的下游引物,33. 5μ LddH2O ;第二輪PCR擴增的反應體系總體積為50μ L,包括1 μ L第 一輪 PCR擴增產物，8yL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5yL 含 Mg2+Plus 的 10XLAPCRBuffer，0. 5 μ L 濃度為 5U/ μ L 的 LATaq，1 μ L 濃度為 IOOpmo/ μ L 的上游引物， 1 μ L濃度為IOpmo/ μ L的下游引物，33. 5 μ LddH2O ;第三輪PCR擴增的反應體系總體積為 50yL，包括 IyL第二輪 PCR擴增產物，8yL 濃度為 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 μ L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCR Buffer，0· 5 μ L 濃度為 5U/ μ L 的 LA Taq，1 μ L 濃度為 IOOpmo/ μ L的上游引物，1 μ L濃度為IOpmo/ μ L的下游引物，33. 5 μ LddH2O ;PCR反應條件 見表1;膠回收目的片段，連接PMD18-T載體，連接產物轉化E. coli Trans Tl感受態細胞， 通過藍白斑篩選陽性克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測序，測序后拼接為1248bp的核 苷酸序列，該未經驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序 列表中的SEQ ID NO: 1所示； 表1
(3)以FN(AB)的基因組DNA為模板，SP4為第一輪PCR的上游引物，SP5為第二輪PCR 的上游引物，SP6為第三輪PCR的上游引物，Genome Walking kit中的簡并引物API、AP2、 AP3、AP4分別為下游引物，經過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未 知序列，第一輪PCR擴增的反應體系總體積為50 μ L，包括1 μ L FN(AB)的基因組DNA，8 μ L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 μ L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer，0· 5 μ L 濃度為5U/ μ L的LA Taq, 1 μ L濃度為IOOpmo/ μ L的上游引物，1 μ L濃度為IOpmo/ μ L的 下游引物，33. 5 μ LddH2O ;第二輪PCR擴增的反應體系總體積為50 μ L，包括1 μ L第一輪PCR 擴增產物，8μ L濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5y L含 Mg2+Plus 的 10XLAPCR Buffer，0· 5 μ L濃度為5U/ μ L的LA Taq，1 μ L濃度為IOOpmo/ μ L的上游引物，1 μ L濃度 為IOpmo/μ L的下游引物，33. 5 μ LddH2O ;第三輪PCR擴增的反應體系總體積為50 μ L，包括 1 μ L第二輪PCR擴增產物，8 μ L濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 μ L含Mg2+Plus 的 10 X LAPCRBuffer，(λ 5 μ L 濃度為 5U/μ L 的 LA Taq，1 μ L 濃度為 IOOpmo/μ L 的上游引 物，1 μ L濃度為IOpmo/ μ L的下游引物，33. 5 μ LddH2O ;PCR反應條件見表2 ;膠回收目的片 段，連接PMD18-T載體，連接產物轉化E. coli Trans Tl感受態細胞，通過藍白斑篩選陽性 克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測序，測序后拼接為1023bp的核苷酸序列，該未經驗證 的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2 所示； 表2
步驟二、壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因未知序列的驗證 (1) 根據步驟一的測序結果，設計引物： jl :5，-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3,， J2 :5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3' ； (2) 壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知序列的驗證 以FN(AB)的基因組DNA為模板，jl為上游引物，SP3為下游引物，采用高保真的 FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的5'端未知序列； PCR反應體系見表4, PCR反應條件：95°C預變性3min，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延 伸50s，30次循環，72°C延伸10min，4°C終止反應；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載 體，連接產物轉化E. coli Trans Tl感受態細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后 拼接為1248bp的核苷酸序列，該經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未 知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示； (3) 壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知序列的驗證 以FN(AB)的基因組DNA為模板，SP6為上游引物，j2為下游引物，采用高保真的 FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的3'端未知序 列，PCR反應體系總體積為50μ L,包括2μ L模板,2μ L濃度為ΙΟμ mol/L的上游引物， 2以1^濃度為 ΙΟμ mol/L 的下游引物，IOyL 5XTransStart FastPfu Buffer, 5以1^濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 μ L 高保真的 FastPfu DNA 聚合酶，28 μ L ddH20, PCR 反應條件：95°C預變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸50s，30次循環，72°C 延伸lOmin，4°C終止反應；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體，連接產物轉化E. coli Trans Tl感受態細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后拼接為1000 bp的核苷酸序 列，該經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中 的 SEQ ID NO:4 所示； (4)經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知序列與3'端未知序列 的拼接與分析 經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列總長度為 1248bp，與公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列 重疊174個堿基，經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列總 長度為lOOObp，與公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷 酸序列重疊272個堿基，根據重疊的核苷酸序列，將經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外 膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布號為AF529887. 1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋 白基因部分核苷酸序列和經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷 酸序列拼接在一起，得到總長度為4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID N0:5所示； 利用NCBI在線工具預測4247bp核苷酸序列的開放閱讀框，預測結果為4247bp核苷酸 序列中含有從ATG到TAA共3372bp的開放閱讀框，該壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因 完整的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:6所示，編碼的1123個氨基酸序列如序列表中 的 SEQ ID NO:7 所示； 步驟三、壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的分段克隆以及原核表達載體的構建 (1) 根據步驟二中獲得的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因完整的核苷酸序列，設 計三對 fPl/rPl、fP2/rP2、fP3/rP3 : fPl :5'-CCGGAATTCTATTCTGGTTCATTGGGTTGGATAAC-3'， rPl :5,-CCGCTCGAGTTAGAAAATAACTCTTAGCCCT-3,， fP2 :5'-CCGGAATTCACAAGTACAGGTGGAAGTGCAACTTTA-3' ， rP2 :5'-CCGCTCGAGTTTAAACTTTTCCCGTTCCTGGAT-3' ， fP3 :5'-CCGGAATTCATGAATCAGGACTCAAGATTGTTCT-3' ， rP3 :5'-CCGCTCGAGTTTAATCACTGGAATAAATAAAGGTTGC-3' ； 分段擴增三個彼此部分重疊且覆蓋壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白整個開放閱讀框 的基因片段pl、p2、p3 ;基因片段pi的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:8所示，其編 碼的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:9所示，基因片段p2的核苷酸序列如序列表中的 SEQ ID N0:10所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:11所示，基因片段p3的 核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 12所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 13所示； (2) 以FN(AB)的基因組DNA為模板，以fPl為上游引物，rPl為下游引物，PCR擴增基 因片段Pl ;以fP2為上游引物，rP2為下游引物，PCR擴增基因片段p2 ;以fP3為上游引物， rP3為下游引物，PCR擴增基因片段p3 ;PCR反應體系總體積為50 μ L，包括2 μ L模板，2 μ L 濃度為10以111〇1/1的上游引物，2 4 1^濃度為1(^111〇1/1的下游引物，1(^1^5\1^1^5七&竹 FastPfu Buffer，5 μ L 濃度為 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 μ L 高保真的 FastPfu 0嫩聚合酶，28以1^(1(1!120，？0?擴增基因片段？1的？0?反應條件為：951：預變性31^11，941： 變性308,601：退火308,721：延伸408,30次循環，721：延伸101^11屮〇?擴增基因片段？2的 PCR反應條件為：95°C預變性3min，94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸40s，30次循環， 72°C延伸IOmin ;PCR擴增基因片段p3的PCR反應條件為：95°C預變性3min，94°C變性30s， 60°C退火30s，72°C延伸40s，30次循環，72°C延伸IOmin ;PCR擴增結束后，取50μ L PCR產 物與上樣緩沖液混勻，在1 %瓊脂糖凝膠中進行核酸電泳，電壓100V，電泳30min后，在紫 外凝膠成像儀下觀察并切下含目的片段的凝膠條帶，置于干凈的EP管中，利用膠回收試劑 盒膠回收目的片段，回收產物置于-20°C保存備用；結果得到大小分別為1203bp、1110bp、 1182bp的特異性目的條帶； (3) 重組克隆質粒的構建 將pEASYblunt simple克隆載體分別與膠回收的基因片段pi、p2、p3連接，連接體系 為：IyL pEASYblunt simple克隆載體，4以1^膠回收產物，251：下連接3〇1^11;將541^