ontpellier、法國）或ISREC服務器中可利用的ALIGN程序中。為了比較氨基 酸序列而使用ALIGN程序的情況下，例如可以利用PAM120殘基質量表，使間隙長度懲罰項 (gap lenth penalty) = 12、間隙懲罰項（gap penalty) = 4〇
[0172] 兩個氨基酸序列的同源性可以使用GCG軟件包的GAP程序，使用Bl〇SS〇m62矩陣 或PAM250矩陣，以間隙加權=12、10、8、6或4,間隙長加權=2、3或4來確定。另外，兩個 核酸序列的同源度可以使用GCG軟件包（http ://www. gcg. com中能夠利用）的GAP程序， 以間隙加權=50、間隙長加權=3來確定。
[0173] 本發明的蛋白質可以是更大的蛋白質（例如融合蛋白質）的一部分。作為融合蛋 白質中所添加的序列，例如可以舉出多重組氨酸殘基這樣的有助于精制的序列、確保重組 生產時的穩定性的添加序列等。
[0174] 具有上述氨基酸序列的本蛋白質可以通過基因工程方法容易地調制。例如可以用 編碼本蛋白質的DNA對合適的宿主細胞（例如大腸桿菌）進行轉染，回收在轉染體內表達 的蛋白質，由此進行調制。所回收的蛋白質根據目的進行適當調制。只要由此作為重組蛋 白質得到本蛋白質即可，可為各種修飾。例如，若將編碼本蛋白質的DNA和其他合適的DNA 插入相同的載體中，使用該載體，進行重組蛋白質的生產，則能夠得到由連接了任意的肽或 蛋白質的重組蛋白質形成的本蛋白質。另外，也可以實施糖鏈及/或脂質的添加、或者N末 端或C末端的處理之類修飾。通過以上的修飾，能夠簡便地進行重組蛋白質的提取和精制、 或者生物學功能的增加等。
[0175] < 2.基因、重組載體、轉染體>
[0176] (1)基因
[0177] 本發明中提供編碼上述蛋白質的基因。一個方案中，本發明的基因包含編碼序列 號10的氨基酸序列的DNA。該方案的具體例是由序列號6或序列號9的堿基序列組成的 DNA〇
[0178] 但是，一般而言，對編碼某個蛋白質的DNA的一部分施加了改變的情況下，改變后 的DNA編碼的蛋白質有時具有與改變前的DNA編碼的蛋白質同等的功能。即，DNA序列的改 變對編碼的蛋白質的功能沒有實質影響，編碼的蛋白質的功能在改變前后被維持。因此，在 本發明中，作為其他的方案，提供具有與序列號6或序列號9的堿基序列等價的堿基序列、 編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA(以下也稱為"等價DNA"）。此處的"等價堿基序 列"是指與序列號6或序列號9所示的核酸部分不同，但其所編碼的蛋白質的功能（此處為 糖質氧化酶活性）沒有因該差異而受到實質影響的堿基序列。
[0179] 等價DNA的具體例是對與序列號6或序列號9的堿基序列互補的堿基序列，在 嚴格條件下進行雜交的DNA。此處的"嚴格條件"是指形成所謂的特異性雜交、不形成非 特異性雜交的條件。這樣的嚴格條件是本領域技術人員公知的，例如可以參照分子克隆 (Molecular Cloning)(第三版，冷泉港實驗室出版，紐約）、現代分子生物學方法（Current protocols in molecular biology) (Frederick M.Ausubel et al?編，1987)進行設定。作 為嚴格條件，例如可以舉出使用雜交液（50%甲酰胺、10XSSC(0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉， 口117.0)、5\061111&"以容液、1%505、10%葡聚糖硫酸、10 1^/1111的改性鮭魚精0嫩、501111磷 酸緩沖液（pH 7. 5))，在約42°C~約50°C培養，之后使用0? 1XSSC、0. 1% SDS在約65°C~ 約70°C進行清洗的條件。作為更優選的嚴格條件，例如可以舉出作為雜交液使用50%甲酰 胺、5XSSC(0.15M NaCl，15mM 檸檬酸鈉，pH 7.0)、lXDenhardt 溶液、1%SDS、10% 葡聚糖 硫酸、l〇μg/ml的改性鮭魚精DNA、50mM磷酸緩沖液（pH 7. 5))的條件。
[0180] 作為等價DNA的其他具體例，可以舉出由以序列號6或序列號9所示的堿基序列 為基準，包含1或多個（優選為1~幾個）堿基的取代、缺失、插入、添加或倒位的堿基序列 組成的、編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA。堿基的取代、缺失等可以在多個部位發 生。此處的"多個"根據該DNA編碼的蛋白質的立體構造中的氨基酸殘基的位置、種類而不 同，例如為2~40堿基，優選為2~20堿基，更優選為2~10堿基。以上的等價DNA例 如可以利用限制酶處理、基于外切酶、DNA連接酶等的處理、基于位置指定突變導入法（分 子克隆（Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港實驗室出版，紐約）、隨機突變導入 法（分子克隆（Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港實驗室出版，紐約）的突變 導入等，對具有序列號6或序列號9所表示的堿基序列的DNA進行改變，使其包含堿基的取 代、缺失、插入、添加及/或倒位而得到。另外，也可以通過紫外線照射等其他方法得到等價 DNA〇
[0181] 作為等價DNA的其他例，可以舉出源于SNP(單核苷酸多態性）所代表的多態性， 能夠識別上述那樣的堿基差異的DNA。
[0182] 本發明的基因可參考本說明書或所附序列表公開的序列信息，使用標準的基因工 程方法、分子生物學方法、生化方法等而調制成分離的狀態。具體而言，可以由合適的頂頭 抱霉（Acremonium chrysogenum)的基因組DNA文庫或cDNA文庫或頂頭抱霉（Acremonium chrysogenum)的菌體內提取液，適當利用對本發明的基因可特異性雜交的低聚核苷酸探 針?引物而調制。低聚核苷酸探針?引物可使用市售的自動化DNA合成裝置等容易地合 成。應予說明，對于為了調制本發明的基因而使用的文庫的制作方法，例如可以參照分子克 隆（Molecular Cloning)，第三版，冷泉港實驗室出版，紐約。
[0183] 例如，若為具有序列號6或序列號9的喊基序列的基因，則可利用以該喊基序列 或其互補序列的整體或一部分為探針的雜交法進行分離。另外，可利用使用以對該堿基序 列的一部分特異性雜交的方式設計的合成低聚核苷酸引物的核酸擴增反應（例如PCR)進 行擴增以及分離。另外，還可以基于序列號10所示的氨基酸序列、序列號6或序列號9的 堿基序列的信息，通過化學合成而得到作為目標的基因（參考文獻：Gene，60(l)，115 - 127(1987))。
[0184] 以下給出本發明的基因的取得方法的具體例。首先，從頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum)中分離、精制本酶（糖質氧化酶），獲得涉及該部分氨基酸序列的信息。作為 部分氨基酸序列確定方法，例如、將精制的糖質氧化酶直接按照常規方法，通過埃德曼降解 法（Journal of Biological Chemistry、第 256 卷、第 7990 ~7997 頁（1981))，供氨基酸 序列分析（蛋白質序列476A、Applied Biosystems公司制等）。使蛋白質水解酶作用，進 行限定水解，對得到的肽片段進行分離、精制，對得到的精制肽片段進行氨基酸序列分析是 有效的。
[0185] 基于由此得到的部分氨基酸序列信息，對糖質氧化酶基因進行克隆。例如可利用 雜交法或PCR進行克隆。在利用雜交法的情況下，例如可以使用分子克隆（第三版，第13 章，冷泉港實驗室出版，紐約）中記載的方法。
[0186] 在利用PCR法的情況下，可以使用以下的方法。首先，以產生糖質氧化酶的微生 物的基因組DNA為模板，使用基于部分氨基酸序列的信息設計的合成寡核苷酸引物，進行 PCR反應，得到目標基因片段。PCR法基于PCR技術〔PCR Technology、Erlich HA編纂、 Stocktonpress公司、1989年發行〕中記載的方法進行。進而，對于該擴增DNA片段，通過通 常使用的方法、例如通過雙脫氧鏈終止法確定堿基序列時，所確定的序列中除了合成低聚 核苷酸引物的序列之外觀察到對應于糖質氧化酶的部分氨基酸序列的序列，能夠獲得目標 糖質氧化酶基因的一部分。以得到的基因片段為探針，進一步進行雜交法等，由此能夠將編 碼糖質氧化酶全長的基因克隆。
[0187] 在后述的實施例中，利用PCR法確定編碼頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum)所 產生的糖質氧化酶的基因的序列。編碼來自于頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum)的糖 質氧化酶的基因的全部堿基序列示于序列號6,編碼該酶的cDNA的全部堿基序列示于序列 號9。另外，確定了該堿基序列所編碼的氨基酸序列（序列號10)。應予說明，對應于序列 號10所示的氨基酸序列的堿基序列除了序列號6或序列號9中記載的以外，還存在多個。
[0188] 通過將全部堿基序列都明確了的糖質氧化酶基因（序列號6)的整體或者一部分 用作雜交用探針，能夠從產生其他糖質氧化酶的微生物的基因組DNA文庫或者cDNA文庫中 選出與序列號6或序列號9的糖質氧化酶基因同源性高的DNA。
[0189] 同樣地可設計PCR用引物。通過使用該引物進行PCR反應，能夠檢測與上述糖質 氧化酶基因同源性高的基因片段，進而還能夠得到其基因整體。
[0190] 制備如上所述得到的基因的蛋白質，測定其糖質氧化酶活性，由此能夠確認是否 為編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質的基因。另外，通過將得到的基因的堿基序列（或其 所編碼的氨基酸序列）與上述糖質氧化酶基因的堿基序列（或其所編碼的氨基酸序列）進 行比較，可以研宄基因構造、同源性，判定是否編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質。
[0191] 因為一次構造以及基因構造確定，所以可通過導入隨機突變或者部位特異性而得 到改變型糖質氧化酶（實施了 1個或多個氨基酸殘基的缺失、添加、插入或取代的基因）。 由此，能夠得到編碼雖然具有糖質氧化酶活性、但最佳溫度、穩定溫度、最佳PH、穩定pH、基 質特異性等性質不同的糖質氧化酶的基因。另外，能夠采用基因工程方法制備改變型糖質 氧化酶。
[0192] 此處，導入突變時的計劃可參考例如基因序列方面的特征序列而進行。特征性序 列的參考例如可通過預測該蛋白質的立體構造、考慮與已知蛋白質的同源性來進行。
[0193] 作為導入隨機突變的方法，例如可以舉出對DNA進行化學處理的方法，即，使亞 硫酸氫鈉作用，引發將胞嘧啶堿基轉換成尿嘧啶堿基的轉型突變的方法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第 79 卷、第 1408 ~1412 頁（1982));生 化方法，即在〔a - S〕dNTP存在下合成雙鏈的過程中產生堿基取代的方法（Gene、第64卷、 第313~319頁（1988));使用PCR的方法，即在反應體系中加入錳進行PCR，降低核苷酸的 導入準確性的方法（Analytical Biochemistry、第224卷、第347~353頁（1995))等。
[0194] 作為導入部位特異性突變的方法，例如可以舉出利用琥珀突變的方法（gapped duplex 法、Nucleic Acids Research、第 12 卷、第 24 號、第 9441 ~9456 頁（1984))、利用 限制酶的識別部位的方法（Analytical Biochemistry、第200卷、第81~88頁（1992)、 GENE、第102卷、第67~70頁（1991))、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖酶）突 變的方法（Kunkel 法、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、 第82卷、第488~492頁（1985))、利用使用DNA聚合酶以及DNA連接酶的琥珀突變的方 法（Oligonucleotide - directed Dual Amber (0DA)法、GENE、第 152 卷、第 271 ~275 頁 (1995)、日本特開平7 - 2892