糖質氧化酶、其制備方法以及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及具有糖質氧化酶活性的蛋白質。更詳言之，涉及作用于大范圍的糖的 具有糖質氧化酶活性的蛋白質、編碼該蛋白質的基因、含有該基因的重組載體、轉染體、以 及上述蛋白質的制備方法及上述蛋白質的用途。
【背景技術】
[0002] 作為對糖質進行氧化的酶的代表，有將葡萄糖氧化的葡萄糖氧化酶，這種葡萄糖 氧化酶在各種領域被廣泛使用。
[0003] 例如，在制備干燥蛋白的過程中，為了除去蛋白中的葡萄糖（脫糖）而使用葡萄糖 氧化酶。干燥蛋白與生蛋白相比能夠長期保存，輸送成本低，保管空間小，從這些方面考慮， 被用作各種食品的原料。該干燥蛋白中的葡萄糖在保存中與雞蛋蛋白質中的氨基反應，發 生美拉德反應，出現褐變，并產生不愉快的氣味。為了防止這樣的品質下降，采用以除去蛋 白中的葡萄糖為目的而使用葡萄糖氧化酶、酵母等的發酵法。
[0004] 但是，因為葡萄糖氧化酶的溫度穩定性比較優異，所以產品中有時殘留葡萄糖氧 化酶活性。例如，在干燥蛋白中殘存葡萄糖氧化酶活性時，出現使用干燥蛋白制作點心時原 料中的葡萄糖被氧化的問題。另一方面，存在如下問題：在葡萄糖氧化酶失活的條件下進行 熱處理時，蛋白凝固，導致作為干燥蛋白的商品價值下降。另外，通過酵母發酵而脫去葡萄 糖的方法存在干燥蛋白產品中殘留發酵味的問題。
[0005] 另外，在面包制作廠、面粉廠中，為了提高小麥粉的燒固性，改善伸縮性，制作具有 所希望的強度以及穩定性的面團，使用葡萄糖氧化酶。作為這種效果的背景機制，可以說是 將坯料中的葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸內酯和過氧化氫，生成的過氧化氫作為氧化劑起作 用，有助于形成面筋S-S鍵。由此，蛋白質形成更穩定的形態，從而改善面團的品質、燒固 產品的容量以及芯構造。
[0006] 具體而言，例如在專利文獻1中公開了為了改善面團的流動學特征、焙燒后的面 包的紋理以及外觀而在谷粉中添加葡萄糖氧化酶的技術。另外，在專利文獻2中公開了用 于改善含有纖維素分解酶以及葡萄糖氧化酶的面包的性質的制劑。進而，專利文獻3中，公 開了含有葡萄糖氧化酶以及脂肪酶的面包制作改良劑以及使用其的面包制作方法。
[0007] 像這樣地葡萄糖氧化酶被用于各種用途，因為是僅將葡萄糖氧化的酶，所以存在 對于不含葡萄糖或者其含量低的物質無法發揮有效的效果的問題。另外，在含有乳糖等其 他糖質的情況下，如果不并用例如乳糖酶等能夠將其他糖質分解成葡萄糖的酶，就無法得 到有效的效果。
[0008] 例如為了使用葡萄糖氧化酶作為對面團以及面包進行改良的添加劑，作為基質， 必須存在葡萄糖，一般來說小麥粉中的葡萄糖為0~0. 4重量％的低含量，所以限制了葡萄 糖氧化酶的有用性。另一方面，已知谷物粉中麥芽糖含量比葡萄糖含量高。
[0009] 為了解決以上的課題，開始關注作用于葡萄糖之外的糖質的糖質氧化酶。例如，專 利文獻4中公開了涉及對D-葡萄糖、D-乳糖、D-纖維二糖、D-麥芽三糖、D-麥芽四 糖、D -麥芽五糖、D -麥芽六糖、D -麥芽七糖各基質顯示良好的反應活性的低聚糖氧化酶 的技術。另外，在專利文獻5中公開了通過使用相比葡萄糖將麥芽糊精或纖維糊精優先氧 化的來自屬于微結節菌屬（Microdochium屬）的微生物的糖質氧化酶，改善面還或面包的 特性的技術。
[0010] 現有技術文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻1:美國專利公開第2783150號
[0013] 專利文獻2:加拿大專利第2012723號
[0014] 專利文獻3:日本特開平4 一 84848號公報
[0015] 專利文獻4:日本特開平5 - 84074號公報
[0016] 專利文獻5:日本特表2001 - 526058號公報
【發明內容】
[0017] 只要是不僅將葡萄糖這樣的單糖類氧化，也將二糖類以上的糖質氧化的酶，與葡 萄糖氧化酶相比，就能夠期待在更廣泛領域中的用途。
[0018] 本發明中，以提供能夠應對各種用途的具有糖質氧化酶活性的新型蛋白質作為主 要目的。
[0019] 本申請人等對具有糖質氧化酶活性的蛋白質進行深入研宄，結果成功地生產出作 用于廣泛的糖、并且、具有適度的溫度穩定性的蛋白質，完成了本發明。
[0020] SP，本發明中提供以下的[1]~[32]。
[0021] [1]
[0022] 一種具有以下理化性質的蛋白質，即，
[0023] (1)作用：將糖氧化而形成糖酸；
[0024] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；以及
[0025] (3)[葡萄糖的Km值]/ [麥芽糖的Km值]彡1。
[0026] [2]
[0027] [1]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0028] [3]
[0029] 一種具有以下理化性質的蛋白質，即，
[0030] (1)作用：將糖氧化而形成糖酸；
[0031] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；
[0032] (3)分子質量：約63kDa(通過SDS - PAGE法測定）。
[0033] [4]
[0034] [3]中記載的蛋白質，其中，[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0035] [5]
[0036] [4]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0037] [6]
[0038] -種具有以下理化性質的蛋白質，即，
[0039] (1)作用：將糖氧化而形成糖酸；
[0040] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；
[0041] (3)最佳 pH: 5.0 ~9.0 ;
[0042] (4)穩定 pH 范圍：5.0 ~10.5 ;
[0043] (5)最佳溫度：2(TC ~55°C ;
[0044] (6)溫度穩定性：在45°C以下穩定；以及
[0045] (7)分子質量：約63kDa(通過SDS - PAGE法測定）。
[0046] [7]
[0047] [6]中記載的蛋白質，其中，[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0048] [8]
[0049] [7]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0050] [9]
[0051] 具有以下理化性質的來自枝頂孢屬（Acremonium屬）微生物的蛋白質，即，
[0052] (1)作用：將糖氧化成糖酸；
[0053] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；以及
[0054] (3)[葡萄糖的Km值]/ [麥芽糖的Km值]彡1。
[0055] [10]
[0056] [9]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0057] [11]
[0058] 具有以下理化性質的來自枝頂孢屬（Acremonium屬）微生物的蛋白質，即，
[0059] (1)作用：將糖氧化成糖酸；
[0060] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；以及
[0061] (3)分子質量：約63kDa(通過SDS - PAGE法測定）。
[0062] [12]
[0063] [11]中記載的蛋白質，其中，[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0064] [13]
[0065] [12]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0066] [14]
[0067] 具有以下理化性質的來自枝頂孢屬（Acremonium屬）微生物的蛋白質，即，
[0068] (1)作用：將糖氧化成糖酸；
[0069] (2)基質特異性：作用于葡萄糖、麥芽三糖、麥芽糖、半乳糖、麥芽四糖、乳糖、纖維 二糖；
[0070] (3)最佳 pH: 5.0 ~9.0 ;
[0071] (4)穩定 pH 范圍：5.0 ~10.5 ;
[0072] (5)最佳溫度：2(TC ~55°C ;
[0073] (6)溫度穩定性：在45°C以下穩定；以及
[0074] (7)分子質量：約63kDa(通過SDS-PAGE法測定）。
[0075] [15]
[0076] [14]中記載的蛋白質，其中，[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0077] [16]
[0078] [15]中記載的蛋白質，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麥芽糖的Km值]彡1。
[0079] [17]
[0080] [9]~[16]中記載的蛋白質，其中，上述枝頂孢屬（Acremonium屬）微生物是頂頭 抱霉（Acremonium chrysogenum) 〇
[0081] [18]
[0082] 以下的（a)、（b)或（c)中記載的蛋白質，即，
[0083] (a)由序列號10所表示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0084] (b)由在序列號10所表示的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1~數個氨基酸 而得的氨基酸序列組成的、具有糖質氧化酶活性的蛋白質；
[0085] (c)由與序列號10所表示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸組成的、 具有糖質氧化酶活性的蛋白質。
[0086] [19]
[0087] -種基因，編碼[18]中記載的蛋白質。
[0088] [20]
[0089] 一種基因，由以下的（a)、（b)或（c)中記載的DNA組成，即，
[0090] (a)由序列號6所表示的堿基序列組成的DNA ;
[0091] (b)由在序列號6所表示的堿基序列中缺失、取代及/或添加1~數個堿基而得的 堿基序列組成的、編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA ;以及
[0092] (c)由與序列號6所表示的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基組成的、編碼 具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA。
[0093] [21]
[0094] -種基因，由以下的（a)、（b)或（c)中記載的DNA組成，即，
[0095] (a)由序列號9所表示的堿基序列組成的DNA ;
[0096] (b)由在序列號9所表示的堿基序列中缺失、取代及/或添加1~數個堿基而得的 堿基序列組成的、編碼具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA ;以及
[0097] (c)由與序列號9所表示的堿基序列具有90%以上的同源性的堿基組成的、編碼 具有糖質氧化酶活性的蛋白質的DNA。
[0098] [22]
[0099] 一種重組載體，含有[19]~[21]中的任一項所述的基因。
[0100] [23]
[0101] 一種轉染體，通過[22]中記載的重組載體對宿主細胞進行轉染而得。
[0102] [24]
[0103] -種蛋白質的制備方法，從培養物中采集[1]~[18]中的任一項所述的蛋白質， 所述培養物是通過在營養培養基中對具有生產[1]~[18]中的任一項所述的蛋白質的能 力的微生物進行培養而得到的物質。
[0104] [25]
[0105] 一種蛋白質的制備方法，將[23]所述的轉染體在培養基中進行培養，從培養物中 收集具有糖質氧化酶活性的蛋白質。
[0106] [