br>[0031] 4.加入220 y L無水己醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
[0032] 5.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中，12000 rpm離屯、30秒，棄 掉流出液。
[0033] 6.加入500 uL CB3 (使用前請先檢查是否已加入無水己醇)，12000巧m離屯、30 秒，棄掉流出液。
[0034] 7.加入500 uL WB3 (使用前請先檢查是否已加入無水己醇)，12000巧m離屯、30 秒，棄掉流出液。
[0035] 8.重復步驟7 -次。
[0036] 9.將吸附柱放回收集管內，12000巧m離屯、2分鐘，徹底去除吸附柱中殘留的 WB3。
[0037] 10.將吸附柱置于一個干凈的離屯、管中，在柱的中央加入100-200 uL EB或去 離子水（pH〉7. 0)，（邸或去離子水在60-70°C水浴預熱，效果更好)，室溫靜置1分鐘，12000 巧m離屯、2分鐘，洗脫DNA。
[003引 11.為得到更多的DNA，進行第二次洗脫，在柱的中央加入100-200 UL邸或去 離子水（pH〉7. 0)，（邸或去離子水在60-70°C水浴預熱，效果更好)，室溫靜置1分鐘，12000 巧m離屯、2分鐘，洗脫DNA。洗脫出的DNA于-20°C保存。
[0039] 12.取5uL提取DNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢查提取效果及DNA濃度；部分 電泳檢測結果見圖1。
[0040] 2.4 PCR擴增目的片段 按照W下反應體系和反應條件獲得目的片段。
[00川 PCR 反應體系；Eas^aq 酶巧 U/y L) 0. 5 y 1，lOXBuffei(含 Mg") 5 y 1，上、下 游引物各 lyl(l0 pM)，2. 5 ml dNTPs 4yl，模板 DNA 巧 0 ng/uL) 4yl，d 地20 34. 5 yl， 總體積50yl，總共50yl。PCR反應條件；95°C預變性3min，95°C變性45s，58°C退火45s， 72°C延生Imin，進行35個循環(變性-退火-延生)，72°C再延伸8min，最后4°C保存；反應 結束后取出PCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果，部分檢測結果見圖2。檢測條 帶明亮、無非特異性擴增條帶的樣品可直接測序，檢測條帶含有非特異性條帶的樣品應切 膠純化后再進行測序。
[0042] 瓊脂糖凝膠電泳檢測的具體方法如下：配1% (w/v)瓊脂糖凝膠，取5 y L擴增的產 物與lyL 6xloading buffer混勻后上樣，120V下電泳25min，紫外判斷PCR結果，如出現 一條專一性條帶表示無非特異性擴增，如出現兩條或W上條條帶表示出現非特異性擴增。
[0043] 2. 5膠回收方法 使用TaKaRa公司DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行純化。操作步驟如下。
[0044] 1.向PCR反應液誠其它酶促反應液)中加入5倍量的Buffer DC咖果需加入 的Buffer DC量不足100 y 1時應加入100 y 1)，然后均勻混合。
[0045] 2.將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection I\ibe 上。
[0046] 3.將上述操作1.的溶液轉移至Spin Column中，室溫1200化pm離屯、1分鐘，棄 濾液。姐）如將濾液再加入Spin Column中離屯、一次，可W提高DNA的回收率。
[0047] 4.將 700 y 1 的 Buffer WB 加入 Spin Column 中，室溫 12000 巧m 離屯、30 秒鐘， 棄濾液。（注）請確認Buffer WB中已經加入了指定體積的100%己醇。
[0048] 5.重復操作步驟4。
[0049] 6.將 Spin Column 安置于 Collection I\ibe 上，室溫 12000 巧m 離屯、1 分鐘。
[0050] 7.將Spin Column安置于新的1. 5 ml的離屯、管上，在Spin Column膜的中央處加 入30 y 1的滅菌水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。（注)將滅菌水或Elution Buffer 加熱至60°C使用時有利于提高洗脫效率。
[005U 8.室溫12000巧m離屯、1分鐘洗脫DM。
[0化引 2. 6PCR產物測序 將PCR產物膠回收結果進行雙向測序。應用DNAstar軟件中的SeqMan程序查看序列， 用化romas軟件查看峰圖。測序由華大基因公司完成。
[0化3] 2. 7尋找SNP位點及位點與結核易感性分析 用DNASTAR軟件中SeqMan程序對序列的rsi37786474號位點的堿基進行對比，得出該 位點的基因型，基因型分為A/A、A/G和G/G型。通過在線分析軟件SNPstats分析該位點與 結核易感性的相關性。BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點患結核風險最高。
[0054] 表1. BOLA-DRB3. 2基因多態性與患結核病風險
【主權項】
1. 一種用于檢測奶牛結核病的檢測標靶，其特征在于：所述的用于檢測奶牛結核病的 檢測標靶為B0LA-DRB3. 2基因。
2. -種用于檢測奶牛結核病易感性的引物，其特征在于：所述引物以B0LA-DRB3. 2基 因的rsl37786474號SNP位點為檢測標靶，根據該SNP位點并距端點I-1000 bp范圍內序列 設計引物，所設計引物長度為20-25bp之間，且能測定BOLA-DRB3. 2基因的基因型。
3. 根據權利要求2所述的用于檢測奶牛結核病易感性的引物，其特征在于： 所述的引物是以BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點為檢測標靶設計的，該 引物能測定BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點的基因型； 所述的以BOLA-DRB3. 2基因 rsl37786474號SNP位點為檢測標靶設計的引物為： 上游引物：5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物：5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。
4. 權利要求2或3所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用。
5. 根據權利要求4所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，包括 如下步驟： 步驟（1)，模板的制備：提取被測奶牛的基因組DNA ; 步驟（2)，引物設計：所述的引物為： 上游引物：5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物：5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3 ; 步驟（3)，PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測； 步驟（4)，對瓊脂糖凝膠電泳檢測無非特異性擴增條帶的PCR產物直接測序，對瓊脂糖 凝膠電泳檢測含有非特異性條帶的PCR產物測序經切膠純化后再進行測序，根據測序結果 對BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點的基因型進行判斷； 步驟（5 )，判定被測奶牛患結核的風險。
6. 根據權利要求5所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，所述 的PCR擴增體系為： EasyTaq 酶，5 U/ μ L，0· 5 μ 1 ; IOXBuffer (含 Mg2+) 5 μ I ; 上、下游引物，10 pM，各1 μ I ; dNTPs，2. 5 πιΜ，4μ 1 ; 模板 DNA，50 ng/ μ L，4 μ I ; ddH20 34. 5 μ I ； 總體積50 μ 1。
7. 根據權利要求5所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，所述 的PCR擴增程序為95 °C預變性3min，95 °C變性45s，58 °C退火45s，72 °C延生Imin，變性-退 火-延生進行35個循環，72°C再延伸8min，最后4°C保存。
8. 根據權利要求5所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，所述 的步驟（3)瓊脂糖凝膠電泳檢測的具體方法如下：配1% (w/v)瓊脂糖凝膠，取5yL擴增的 產物與I U L 6xloading buffer混勾后上樣，120V下電泳25min，紫外判斷PCR結果，如出現 一條專一性條帶表示無非特異性擴增，如出現兩條或以上條條帶表示出現非特異性擴增。
9. 根據權利要求5所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，所述 的對B0LA-DRB3. 2基因的rs 137786474號SNP位點的基因型的具體判斷方法為：用DNASTAR 軟件中SeqMan程序對序列的rsl37786474號位點的堿基進行對比，得出該位點的基因型， 基因型分為A/A、A/G和G/G型。
10. 根據權利要求5所述的引物在檢測奶牛結核病易感性中的應用，其特征在于，所述 的判定被測奶牛患結核的風險的具體步驟為：B 〇LA-DRB3. 2基因 rsl37786474號SNP位點 的基因型為A/A基因型的牛只患結核性的風險最高，G/G基因型患結核病的風險為A/A基因 型的0. 5-0. 55倍，A/G基因型患結核的風險最低，然后根據BoLA-DRB3. 2基因 rsl37786474 號SNP位點的基因型將牛群分類管理。
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測奶牛結核病易感性的檢測標靶及引物，屬于生物醫學技術領域。本發明通過所述引物對奶牛外周血基因組中BOLA-DRB3.2基因的多態性進行檢測，并以所述SNP位點為標靶設計引物：上游：5’-CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3’，下游:5’-AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3’，測定樣品基因型，通過測定樣品中上述基因的基因型來評估患結核病的風險，為實現對個體患結核病預警風險的評估提供一種方案，為奶牛結核病凈化及抗結核健康奶牛種群選育提供一種方法。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104630365
【申請號】CN201510064328
【發明人】張以芳, 秦波, 王生奎, 王清露, 史憲偉, 張辰宇, 柴俊, 柳桐, 王有濤
【申請人】云南農業大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月9日