一種檢測奶牛結核易感性的檢測標靶及引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，設及一種檢測奶牛結核易感性的檢測標祀及引 物，具體設及通過檢測基因SNP位點多態性來判斷奶牛對結核的易感性。
【背景技術】
[0002] 奶牛結核病是由牛結核分支桿菌引起的重要的人畜共患的慢性消耗性傳染病，曾 被稱為"白色癌疫"。由于潛伏期長（1-10年)、缺乏有效的防治手段，既沒有有效的疫苗預 防，也沒有特效的藥物治療，國內外檢出結核病牛，采用的方法均是隔離、撲殺及凈化，經濟 損失巨大，并帶來嚴重的公共衛生安全隱患，對公共衛生安全帶來極大威脅。
[0003] 根據世界衛生組織及糧農組織公布，大約10%人類結核由奶牛結核傳染，近年來， 隨著結核桿菌耐藥菌株的出現，結核病在近年又死灰復燃，全球結核病每年的新增病例約8 百萬，每年約有300萬人死于結核病，即大約每10秒鐘有一個人死于結核病；中國具有遠高 于世界平均水平的結核病發病率，是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核病患者數量 居世界第二位。隨著我國近年奶牛業的發展，奶牛結核亦有上升趨勢。
[0004] 由于目前對牛結核分枝桿菌的致病機理了解甚少，結核病的防控基礎研究受到了 嚴重制約，進行牛結核病抵抗力和易感性研究，篩選奶牛結核病易感高風險因子，為區分易 感牛群和健康牛群，選擇健康牛群有重要意義。
[000引 BoLA即牛白細胞抗原，也就是牛的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC)，又稱主要組織相容性復合基因，包括一系列緊密連 鎖、高度多態性的基因座，與機體的免疫系統功能密切相關。BOLA-DRB3. 2基因是牛白細胞 抗原基因的外顯子1，位于23號染色體上，所編碼的血1C- II分子在免疫系統中發揮著非常 重要的作用。研究表明，BOLA-DRB3. 2基因與家畜的抗病性和易感性有著密切的關系，且現 已發現BOLA-DRB3. 2基因與奶牛對乳房炎等疾病的易感性存在相關性。在對人的HLA基 因與結核相關性研究發現，HLA-DRB基因與人結核病抵抗力存在極大的相關性。但是對于 BOLA-DRB3. 2基因與牛結核易感性相關性的研究很少，需要進一步的實驗來確定。
【發明內容】
[0006] 由于目前針對奶牛結核易感性檢測的方法很少，所W尋求一種新的、有效的奶牛 結合易感性的檢測方法對奶牛結核病凈化及健康種群培育具有很大的意義，對于該一問 題，本發明提供了一對檢測奶牛結核易感性的引物。
[0007] 本發明采用的技術方案如下； 本發明的第一方面為提供一種用于檢測奶牛結核易感性的檢測標祀，即BOLA-DRB3. 2 基因。
[000引本發明的第二個方面為提供一種用于檢測奶牛結核易感性的引物，即W B0LA-DRB3. 2基因的rs 137786474號SNP位點為檢測標祀，根據該SNP位點并距端點 1-lOOObp范圍內序列設計引物，所設計引物長度為20-25bp之間，且能測定B0LA-DRB3. 2基 因的基因型。
[0009] 所述的引物是W BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點為檢測標祀設計 的，該引物能測定BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點的基因型； 所述的W BOLA-DRB3. 2基因r rsl37786474號SNP位點為檢測標祀的設計的引物是； 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 SEQ ID No. 1 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3 沈Q ID No. 2 ; 所述W BoLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點的測序引物是； 5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 沈Q ID No. 1。
[0010] 本發明的第=方面是將提供引物運用于奶牛結核易感性檢測中。
[0011] 具體包括如下步驟： 步驟（1)，模板的制備；提取被測奶牛的基因組DNA ; 步驟（2)，引物設計；所述的引物為： 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。
[0012] 步驟（3)，PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測； 步驟（4)，對瓊脂糖凝膠電泳檢測無非特異性擴增條帶的PCR產物直接測序，對瓊脂糖 凝膠電泳檢測含有非特異性條帶的PCR產物測序經切膠純化后再進行測序，根據測序結果 對B0LA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點的基因型進行判斷； 步驟（5)，判定被測奶牛患結核的風險。
[0013] 上述技術方案中，所述的PCR擴增體系為： Eas}fTaq 酶，5 U/ y L，0. 5 y 1 ; lOXBuffer (含 Mg") 5y 1 ; 上、下游引物，10 pM，各lyl ; dNTPs，2. 5 mM，4y 1 ; 模板DNA，50 ng/uL，4y 1 ; dd&O ：M. 5 y 1 ; 總體積50yl。
[0014] 上述技術方案中，所述的PCR擴增程序為95°C預變性3min，95°C變性45s，58°C退 火45s，72°C延生Imin，進行35個循環(變性-退火-延生)，72°C再延生8min，最后4°C保 存。
[0015] 上述技術方案中，所述的步驟（3)瓊脂糖凝膠電泳檢測的具體方法如下：配1% (w/ V)瓊脂糖凝膠，取5]iL擴增的產物與lyL lOxloading buffer混勻后上樣，120V下電泳 25min，紫外判斷PCR結果。巧日出現一條專一性條帶表示無非特異性擴增，如出現兩條或W 上條條帶表示出現非特異性擴增） 上述技術方案中，所述的對B0LA-DRB3. 2基因的rsl37786474號SNP位點的基因型的 具體判斷方法為：用DNASTAR軟件中SeqMan程序對序列的rs 137786474號位點的堿基進行 對比，得出該位點的基因型，基因型分為A/A、A/G和G/G型 上述技術方案中，所述的判定被測奶牛患結核的風險的具體步驟為；BOLA-DRB3. 2基 因rsl37786474號SNP位點的基因型為A/A基因型的牛只患結核性的風險最高，G/G基因 型患結核病的風險為A/A基因型的0. 5-0. 55倍，A/G基因型患結核的風險最低，然后根據 BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點的基因型將牛群分類管理。
[0016] 本發明與現有技術相比，其有益效果為： 本發明自行設計引物，Wrsl37786474號SNP位點為標祀設計引物，通過該引物檢測奶 牛外周血基因組DNA中的BOLA-DRB3.2基因的多態性，測定各樣品的基因型，并通過測定的 基因型來評估奶牛患結核病的風險，對實現個體患結核病預警風險的評估提供W-種新的 方案。
[0017]
【附圖說明】： 圖1為18頭被測奶牛DNA樣品的電泳檢測圖；其中M為化2000分子量標記； 圖2為10頭被測奶牛DNA樣品PCR擴增后的電泳檢測圖；其中M為化2000分子量標 記。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0019] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過購買獲得的 常規產品。
[0020] 發明人研究發現BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點的多態性與奶牛的 結核病的易感性相關，可W對奶牛個體對結核病患病風險進行評估，本發明實現了通過 BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點多態性檢測奶牛結核易感性。
[002U 對BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點基因型檢測方法可W采用DM測序 法、限制性酶切片段長度多態性、焦磯酸測序法、Taqman探針法等。
[002引下面通過DNA測序法，對本發明所述引物的運用進行詳細介紹。
[0023] 一.實驗材料與方法 1.實驗材料 1. 1實驗樣品 W云南省昆明、玉溪和大理地區的奶牛為研究對象，經PPD皮內變態反應試驗檢測的 陽性樣本126份，陰性樣本165份，共291份。
[0024] 1. 2實驗試劑 全式金全血DNA提取試劑盒、TaKaRa公司DNA膠回收試劑盒。Easy Taq酶購全式 京有限公司，DL 2000Mark購自寶生物工程(大連）有限公司。凝膠成像儀、PCR擴增儀購自 BIO-RAD公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。
[0025] 2.實驗方法 2. 1樣品采集 對經過PPD檢測后的牛進行血樣采集。陽性樣品為兩次PPD檢測均為陽性的牛只血。 陰性牛為兩次PPD試驗均為陰性的且與陽性牛同一牛場，同一圈舍，年齡±8歲的牛只的血 樣。樣品全部為抗凝全血，并于-20°C保存。放入冰盒運回實驗室-80°C儲存。
[0026] 2.2引物設計 PCR檢測BoLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點多態性引物； 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。
[0027] 用于BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474號SNP位點的測序引物； 5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3。
[002引 2. 3全血基因組提取 按照全式金全血DNA提取試劑盒提取DNA說明書要求提取DNA，其方法為： 1.在1.5血EP管中加入200 uL全血。
[0029] 2.加入 20 y L Proteinase K 溶液，混勻。
[0030] 3.加入220 y 1 BB3,充分顛倒混勻，56°C放置10分鐘，期間混勻數次，溶液應變 為清亮(如溶液未徹底變清亮，請延長裂解時間至溶液清亮為止)。加入BB3時可能會產生 白色沉淀，一般56°C放置時會消失，不會影響后續實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不 徹底，可能導致提取DNA量少和提取出的DNA不純。<