形式的融合蛋白后，獲得來自所述細胞的重組肽。該融合蛋白以包涵體形式表達，增 加了所述重組肽的產率，并保護了所述目標肽的完整性。
[0047] 本發明的第二實施方案涉及一種改進的方法，以通過在超折疊綠色熒光蛋白中插 入一個或多個組氨酸標簽來簡化純化步驟。由化學試劑或內肽酶裂解所述融合蛋白后，所 述超折疊綠色熒光蛋白標簽可以通過重復組氨酸標簽親和純化得以除去。籍此，一般可以 減少來自其它細胞蛋白裂解過程的污染物。
[0048] 第三實施方案涉及一種表達所述融合蛋白的方法，其中甲硫氨酸殘基連接所述目 標肽和所述載體超折疊綠色熒光蛋白。所述融合蛋白以包涵體形式表達，并在變性條件例 如用尿素或鹽酸胍下純化。所述融合蛋白可以溶解于甲酸，然后用溴化氰裂解，以釋放所述 目標肽。在裂解所述融合蛋白后，包含超折疊綠色熒光蛋白的片段可以通過色譜法除去。
[0049] 第四實施方案涉及一種表達含有甲硫氨酸殘基的目標肽的方法。所述融合蛋白以 包涵體形式表達，并在變性條件下例如用尿素或鹽酸胍純化。所述融合蛋白可以通過相對 生理緩沖液透析而重折疊。然后，可以用蛋白水解酶如胰蛋白酶、TEV蛋白酶或凝血酶裂解 所述融合蛋白以釋放所述目標肽。在裂解所述融合蛋白后，可以通過色譜去除含有超折疊 綠色熒光蛋白的片段。
[0050] 本發明的第五實施方案涉及所述目標肽與載體蛋白超折疊綠色熒光蛋白的氮末 端或碳末端的融合物，如圖IA和圖IB所示。所述目標肽的大小可以是10到200個氨基酸 殘基。所述載體蛋白具有SEQ ID NO :1中列出的氣基酸序列。
[0051] 所述融合蛋白的大小會隨著所述目標肽的性質和拷貝數量而有變化。所述融合蛋 白應該足夠大，以避免被內源性蛋白酶降解。所述融合蛋白可以如圖IA和圖IB中所示的 兩種方式進行排列。或者，所述目標肽與載體蛋白（超折疊綠色熒光蛋白）的N-末端或 C-末端通過具體氨基酸序列的裂解位點（圖2A和圖2B)連接。在圖2A和圖2B中，裂解位 點包含的氨基酸或氨基酸的序列，提供了化學反應或酶反應的識別位點，使得所述的化學 試劑或酶裂解該位點的肽鏈。
[0052] 所述目標肽可以由10到200氨基酸殘基的一個或多個連續序列組成。大的肽特 別是來源于沒有獨特三維結構的蛋白序列的那些。多種目標肽可以有如圖3A和圖3B所示 的幾種形式。在圖3A中，一個包括單個拷貝的所述目標肽。在圖3B中，另一個由多個串聯 重復的單個目標肽組成。每個重復序列可以是相同的或不同的肽，所述重復由"互連"序列 連接，所述"互連"序列可以是 Met、Lys、Arg、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO : 3)、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Ser(SEQ ID N0:5)或其他合適的氨基酸序列。所述互連序 列不是必須與連接所述載體蛋白和所述目標肽的"連接"序列不同。使用不同的連接連接 體提供了這樣的優點，即兩個或多個不同的裂解劑（如化學物質或酶）可以從所述融合蛋 白中逐個地釋放所述目標肽并將所述每個目標肽彼此分離。
[0053] 所述融合的肽的具體實施方案是目標肽可以以單個的或多個連接的重復出現，其 包括可的瑞林、甲狀旁腺素、胰高血糖素樣肽及其衍生物艾塞那肽和利拉魯肽、恩夫韋肽、 降血鈣素、比伐盧定、齊考諾肽、舍莫瑞林、生長瑞林、分泌素、替度魯肽和胰島素原、水蛭 素、生長激素、生長因子、生長激素釋放因子、促腎上腺皮質激素、釋放因子、德舍瑞林、去氨 加壓素、依降鈣素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黃體（生成）激素釋放激素、分泌素、生長激素 抑制素、促甲狀腺激素釋放激素、曲普瑞林、血管活性腸肽、干擾素、甲狀旁腺激素、BH3肽、 β -淀粉樣變肽。這些肽的一個共同特性是它們都具有柔性和脆弱的構象，使它們不穩定， 容易蛋白水解式降解。
[0054] 所述裂解位點和所述目標肽優選經過選擇，以使所述目標肽不包含相同裂解位 點。所述裂解位點包括 Met、Lys、Arg、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO :3)、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Ser(SEQ ID N0:5)或其他合適的氨基酸序列。可以設計新的 裂解位點，以使用化學裂解劑或酶或這兩者的組合。在某些情況下，可能需要利用裂解位點 將具體的功能基團引入到所述目標肽的C-末端，比如通過溴化氰裂解。
[0055] 編碼所述目標肽的DNA序列可以獲自天然來源（如基因組DNA)，也可以利用細菌 細胞或其它宿主細胞的密碼子偏愛性通過化學合成獲得。
[0056] 本發明的一個實施方案提供了一種從基因組DNA中擴增編碼具體肽的DNA序列的 方法。通常情況下，設計兩個引物以在PCR產物的兩端引入兩個獨特的限制性內切酶切位 點。所述PCR反應在可以控制反應溫度的PCR擴增設備上進行。PCR DNA聚合酶，例如Taq 酶、Pfu酶、Phusion DNA聚合酶，被用于PCR反應中，反應條件采用供應商提供的方案。PCR 產物用至少一種限制性內切酶直接消化，或者若有必要，在被限制性內切酶消化前進行清 洗步驟。所述消化反應混合物用DNA純化方法進行凈化。DNA的純化可以通過使用瓊脂糖 凝膠電泳或PCR純化試劑盒來實現。所述純化的PCR產物作為編碼目標肽的插入物。在一 些實例中，編碼所述目標肽的插入物不能從天然來源獲得。在該后一種情形中，編碼所述目 標肽的DNA片段通過化學合成制備。通常，至少兩個寡核苷酸引物是化學合成的，且每一末 端至少含有一個限制性內切酶位點。這兩個寡核苷酸在中間區域有至少10個堿基對可以 是互補或重疊的。PCR擴增可以用于通過重疊的寡核苷酸序列生成完整的插入物。
[0057] 編碼融合蛋白的DNA序列包含至少四個部分，包括親和標簽的DNA序列、載體蛋白 (超折萱綠色灰光蛋白）的DNA序列、裂解位點的DNA序列和目標狀的DNA序列。典型地， DNA序列片段的排列可以與圖2A和圖2B中描述的相同。所述親和標簽的DNA序列可以被 插入在融合蛋白DNA序列中的任何位置。該融合蛋白的DNA序列可以被連接到任何的細菌 表達質粒中，以構建表達載體。該表達載體含有至少一個啟動子，如lac、T7、Tac、lamda、pL 或pBAD和一個抗生素標記，如氨芐青霉素，卡那霉素或四環素。
[0058] 所構建的表達載體可以被轉化到細菌宿主細胞以復制質粒，用于小規模DNA制備 (小量制備）和測序。所述構建體通過DNA測序以對其進行確認，再將所述表達載體轉化細 菌宿主細胞以表達所述融合蛋白。含有所述融合蛋白表達載體的細胞可以在存在至少一種 抗生素的LB培養基或基本培養基中培養。該融合蛋白的表達被誘導劑誘導，所述誘導劑例 如IPTG、半乳糖苷、萘啶酸、溫度或阿拉伯糖。
[0059] 融合蛋白的純化是指將該融合蛋白從宿主細胞中分離出來的過程。細胞一般通過 離心或過濾收集。通常將細胞沉淀重懸在含有50mM磷酸鹽、IOmM Tris和50mM NaCl的裂 解緩沖液中。所述裂解緩沖液可以包含離散劑，例如尿素或鹽酸胍。懸浮的細胞可進一步經 受French Press或超聲處理，以徹底破壞細胞。將所述裂解物離心以從其它成分分離出所 需的融合蛋白。在一些情況下，該融合蛋白是以純包涵體的形式從細胞中分離出來的。所述 包涵體可通過常規技術從粗制細胞裂解物中分離，例如通過離心。所述粗制包涵體可以經 過初步純化步驟，例如以50mM磷酸鹽、ImM EDTA，pH為7. 5的溶液洗一次，然后以含低濃度 離散計例如尿素或鹽酸胍的相同緩沖液洗滌至少兩次。將純包涵體溶解在高濃度的離散緩 沖液中，然后進行重折疊。重折疊過程可以通過在生理緩沖液中進行透析所述懸浮的樣品， 或通過反相色譜柱除鹽，再進行冷凍干燥。在一些情況下，所述融合蛋白以細胞內不溶包涵 體形式產生，但沒有設計親和標簽。在這種情況下，在裂解物中的所述融合蛋白通過溶劑提 取粗純后再用離子交換色譜法進一步純化。如果有必要，該融合蛋白可通過反相HPLC進行 純化。在其它情況下，該融合蛋白可以通過親和色譜法，如作為組氨酸標簽結合的Ni-NTA 親和珠，在天然條件下或在變性條件下進行純化。
[0060] 在裂解后，所述混合物被用來將所述目標肽從所述載體蛋白分離出來。在一些實 例中，該混合物可以直接用于HPLC純化。將所述混合物的pH值調節到低于3. 0，在HPLC純 化之前將樣品過濾，以去除固體顆粒。在一些實例中，該混合物用水稀釋（如至大約10倍）， 并冷凍以干燥，然后用反相HPLC柱純化，使用含0. 1 % TFA的乙腈-水梯度。在其他實例中， 該混合物最初通過組氨酸標簽親和色譜法和反相色譜法純化，以除去鹽、載體蛋白、未消化 的融合蛋白以及非特異性消化的肽。最后，將純的肽凍干，并由質譜進行確認。
[0061] 表1列出了下文示例的一些重組肽，它們在本發明中已經被表達。數據顯示，目前 表達系統可以高效地、高產量地產生純肽。
[0062] 表1所表達的重組肽的實例
[0063]
【主權項】
1. 一種用于表達目標肽的融合載體蛋白。所述融合載體蛋白來源于超折疊綠色熒光蛋 白或其變體。