由超折疊綠色熒光蛋白構成的融合蛋白及其用圖
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 本申請是要求在2012年3月23日遞交的美國臨時申請No. 61/615, 178的權益和 優先權，該美國臨時申請的全部內容以引用的方式并入本文中。
技術領域
[0003] 本發明在廣義上涉及含有小于200個氨基酸殘基的重組肽和一個或多個源于超 折疊綠色熒光蛋白或其變體的新的載體蛋白或變體，以及使用源于超折疊綠色熒光蛋白或 其突變體的新的載體蛋白生產重組肽的方法。
【背景技術】
[0004] 肽是一類生物分子，其被廣泛地在許多生物醫學研宄領域中用作試劑、在疾病的 治療中用作治療性藥物、在檢測病原菌中用作診斷劑以及用作生物標記物。合成肽通常有 兩種方法，一種是化學合成，另外一種是重組表達。化學合成已被用于制備多種治療性肽， 包括可的瑞林、甲狀旁腺素（PTH)、胰高血糖素樣肽（GLP-I)及其衍生物艾塞那肽和利拉魯 肽、恩夫韋肽、降血鈣素、比伐盧定、齊考諾肽、舍莫瑞林、生長瑞林、分泌素、替度魯肽和胰 島素。該方法需要氨基酸片段的多步縮合而形成肽，同時也需要繁瑣的保護、去保護和純化 等步驟。到目前為止，大多數低于50個氨基酸殘基的商業化肽是用這種方法生產。由于制 藥行業和生物醫學研宄中肽的需求在不斷增加，用于化學合成的氨基酸片段的價格也在持 續攀升。因此，日常使用的治療性肽藥物比如GLP-I類似物，在未來將難以保持可以承受的 價格。盡管化學合成小于50個氨基酸殘基的肽在技術上是可行的，但較低的產量以及合成 過程中產生的大量的有機廢物是相當不合算的。現在，大多數超過50個氨基酸殘基的肽是 在細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物等細胞宿主中重組表達的。多年來，使用融合蛋白表達多肽一 直是比較常用的方法。可用的載體蛋白包括谷胱甘肽-S-轉移酶（W094/04688 and Ray et al.，BioTechnology, 11，64, 1993)、核酬糖激酶（US patent No. 5, 206, 154 and Callaway et al.，Antimicrob. Agents&Chemo.，37, 1614-1919, 1993)、gp-55 蛋白（Gram H. et al.， Biotechnology, 12, 1017-1023, 1994)、類固醇異構酶（Kuliopulos A. et al.，J. Am. Chem. Soc·，116,4599-4607, 1994)、泛素 （Pilon A. et al.，Biotecnol.Prog. 374-379, 1997)、 牛凝乳酶原（Hauht et al.，Biotechnolo. Bioengineer· ,7, 55-61，1998)、GBl 結構 域（Darrinm et al·，Biochemistry, 41，7267-7274,2003)、RNA 結合蛋白（Sharon M.et al·，Protein Exp. And Purif·，24, 374-383, 2002)、SH2 結構域（Fairlie W.et al.，Protein Exp. And Purif. 26, 171-178, 2002)、纖維素酶結合蛋白、小泛素樣修飾蛋白、 內含肽、抗菌/增加通透性的蛋白、碳酸酐酶（US Patent N〇:5,962,270 and W097/29127)、 乳清蛋白（W095/27782)、beta-牛乳糖（Shen S.，PNAS, 281，4627-4631，1984)以及氯霉素 乙酰轉移酶（Dykes C.et al·，European Journal of Biochemistry, 174, 411-416, 1988) 〇 選擇這些融合載體是因為它們在宿主細胞內具有相對高的表達水平和快速折疊的特性。雖 然可用，但使用融合載體蛋白重組表達的肽的終產率一般不會超過l〇〇mg/L。此外，用于肽 表達的現在可用的融合蛋白方法有許多技術上的問題，尤其對于產生小于50個氨基酸殘 基的肽（Vileghe et al·，Drug Discovery Today, 15, 40-56, 2010) 〇
[0005] 非常有必要研發一種新的載體蛋白，所述新的載體蛋白克服其它現有載體蛋白產 生重組肽的限制。
【發明內容】
[0006] 本發明至少部分基于這樣的意外發現：超折疊綠色熒光蛋白或其變體當被用作載 體蛋白時，在細菌細胞的細胞質或者包涵體中會得到高表達水平的重組肽。因此，本發明的 一個方面涉及一種用于構建用于產生作為融合蛋白的重組肽的穩定表達系統的新的載體 蛋白。具體而言，所述載體蛋白包括超折疊綠色熒光蛋白或其變體。
[0007] 在一個實施方案中，所產生的融合蛋白以完整和穩定的形式表達。在一個實施方 案中，所述新的載體蛋白容易通過方便的方法去除并且不會使后續的肽純化步驟復雜化。 在本發明的一個實施方案中，所述目標肽被靶向以通過對本發明的載體蛋白進行基因工程 而形成包涵體，用于避免細胞內的蛋白水解式降解。依據本發明，提供了一種用于表達目標 肽的融合載體蛋白，該融合載體蛋白來自于超折疊綠色熒光蛋白或者其變體，長度包括237 個或者更多個氨基酸。優選地，所述的融合載體蛋白的氨基酸序列在結構式I中列出：
[0008] T1-A1-T2(I)
[0009] 其中，
[0010] Tl為不存在、甲硫氨酸、組氨酸標簽或者至少一個肽裂解位點；
[0011] Al為超折置綠色灰光蛋白；
[0012] T2為不存在、組氨酸標簽或者至少一個肽裂解位點，條件是Tl和T2至多有一個不 存在。
[0013] 在實施方案中，Al為超折萱綠色焚光蛋白，所述蛋白具有如下氣基酸序列：Ser-L yS-Gly-Glu-Glu-Leu-Phe-Thr-Gly-Val-Val-Pro-Ile-Leu-Val-Glu-Leu-Asp-Gly-Asp-Va I-Asn-Gly-His-Lys-Phe-Ser-Val-Arg-Gly-Glu-Gly-Glu-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Gly-Lys -Leu-Thr-Leu-Lys-Phe-Ile-Cys-Thr-Thr-Gly-Lys-Leu-Pro-Val-Pro-Trp-Pro-Thr-Leu-Val-Thr-Thr-Leu-Thr-Tyr-Gly-Val-Gln-Cys-Phe-Ser-Arg-Tyr-Pro-Asp-His-Met-Lys-A rg-His-Asp-Phe-Phe-LyS-Ser-Ala-Met-Pro-Glu-Gly-Tyr-Val-Gln-Glu-Arg-Thr-Ile-Se r-Phe-Lys-Asp-Asp-Gly-Thr-Tyr-LyS-Thr-Arg-Ala-Glu-Val-Lys-Phe-Glu-Gly-Asp-Thr -Leu-Val-Asn-Arg-Ile-Glu-Leu-Lys-Gly-Ile-Asp-Phe-Lys-Glu-Asp-Gly-Asn-Ile-Leu-Gly-His-Lys-Leu-Glu-Tyr-Asn-Phe-Asn-Ser-His-Asn-Val-Tyr-Ile-Thr-Ala-Asp-Lys-G In-Lys-Asn-Gly-Ile-Lys-Ala-Asn-Phe-Lys-Ile-Arg-His-Asn-Val-Glu-Asp-Gly-Ser-Va I-Gln-Leu-Ala-Asp-His-Tyr-Gln-Gln-Asn-Thr-Pro-Ile-Gly-Asp-Gly-Pro-Val-Leu-Leu -Pro-Asp-Asn-His-Tyr-Leu-Ser-Thr-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Lys-Asp-Pro-Asn-Glu-Lys-Arg-Asp-His-Met-Val-Leu-Leu-Glu-Phe-Val-Thr-Ala-Ala-Gly-Ile-Thr-His-Gly-Met-A sp-Glu-Leu-Tyr-Lys(SEQIDN0 :l)，或與SEQIDN0:l至少80%，至少90%，至少95%， 至少97%或者至少99%相同的氨基酸序列。
[0014] 肽裂解位點可以選自例如：Met、Cys、Pro、Asn、Glu、Tyr、Trp、Lys、Arg、 Asn-Gly、Asp-Met-Gln-Asp-Ile、Asp-Glu-Val-Asp-Ile、Leu-Glu-Val-Asp-Ile、 Trp-Glu-His-Asp-Ile、 Leu-Glu-His-Asp-Ile、 Val-Glu-Ile-Asp-Ile、 Val-Glu-His-Asp-Ile、 Ile-Glu-Thr-Asp-Ile、 Leu-Glu-Thr-Asp-Ile、 Ile-Glu-Ala-Asp-Ile、 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、 Arg-Gly-Glu-Iie、 Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ala、Ile_Glu-Pr〇-Asp-Ile、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-