多肽鏈的C末端包含SrtA識別基序的結合實體（例如單鏈抗原結合多 肽如scFv、scFab或darpin，或多鏈抗原結合多肽如dsFv或Fab)可以從真核細胞（例如 HEK293細胞、CHO細胞）表達并且從其上清液純化。
[0221] "Combimatrix" 方案
[0222] 理想的是將第一結合實體如抗體Fab片段與另一種特異性結合實體如包含全長 重鏈及其同族全長輕鏈和二硫鍵連接的重鏈Fe區多肽的第二抗體Fab片段或單臂抗體片 段組合。此外當第一結合實體與許多不同其他結合實體連接時，可以篩選第一結合實體是 否顯示更好的特性。使用所謂的Combimatrix方案，可以用便利方式確定結合實體的多種 組合。應當指出第二結合實體可以與不同靶/表位/抗原結合，或可以與相同抗原結合但 是結合至不同表位，或可以與相同表位結合，不過是單一結合實體的不同變體（例如人源 化候選物）。
[0223] 在這種情況下，可以實施自動化平臺方法。使用例如96孔板或其他高通量模式的 任何平臺是合適的，如Eppendorf epMotion 5075vac移液機器人。
[0224] 首先，進行編碼結合實體的構建體的克隆。通常通過基因合成或PCR擴增獲得帶 有編碼結合實體的核酸的質粒，以此一個被編碼的結合實體的C末端區含有分選酶基序， 和內質網駐留信號，并且各個其他結合實體的N末端區包含N末端寡甘氨酸基序，其包含 或是至少兩個連續的甘氨酸殘基（二甘氨酸）。將質粒各自轉移至多孔板的分開的板孔中 (可以加載整塊平板）。此后，質粒用切下結合實體編碼區的限制性酶混合物消化。理想的 是以全部質粒僅需要一種限制性酶混合物的方式設計全部基因合成和/或PCR引物。此后， 任選的清潔步驟產生純化的DNA片段。將這些片段連接至已經用與如上文提到的相同的限 制性酶混合切去受體載體的質粒骨架中。備選地，克隆流程可以由SLIC介導的克隆步驟執 行。在連接后，自動化平臺將全部連接混合物轉移至另外的具有感受態大腸桿菌細胞的多 孔板（例如ToplOMulti Shot，Invitrogen)，并且進行轉化反應。將細胞培育至所需的密 度。從培養混合物的等分試樣可以獲得甘油貯藏物。從培養物分離質粒（例如使用質粒分 離微量試劑盒（例如NucleoSpin 96 Plasmid，Macherey& Nagel))。通過用適宜的限制酶 混合物消化等分試樣和SDS凝膠電泳（例如E-Gel 48, Invitrogen)驗證質粒身份。此后， 新平板可以用質粒的等分試樣加載以進行對照測序反應。
[0225] 在下一個步驟中表達結合實體。為此，將HEK細胞接種到多孔板（例如48孔-平 板）上并且用各個分離的質粒組合（在適宜的骨架載體中含有結合實體編碼區）連同編碼 具有C末端內質駐留信號的可溶分選酶的質粒轉染。因此，用三種表達質粒共轉染HEK細 胞：i)編碼具有C末端His標簽，分選酶基序和內質駐留信號（以N末端至C末端方向）的 結合實體的質粒，ii)編碼具有至少兩個甘氨酸殘基的N末端寡甘氨酸基序的結合實體的 質粒和iii)編碼具有C末端內質駐留信號的可溶分選酶的質粒。將轉染的HEK細胞培育 幾日并隨后收獲培養物上清（例如通過使用真空工作站經1. 2 μ m和0. 22 μ m濾板過濾）。 可以通過實施例如ELISA監測滴度。
[0226] 在體內表達期間利用分選酶介導的轉肽反應，結合實體可以彼此連接。這是因為 包含C末端分選酶識別基序的結合結構域包含內質網駐留信號而實現的。采用的可溶分選 酶在其C末端包含相同的內質網駐留信號。因此，這兩個分子均幾乎全部駐留在內質網中。 當第二多肽結構域進入內質網中時，發生酶促綴合反應，并且將缺乏內質網駐留信號（在 酶促轉肽反應過程中被移除）的酶促綴合物分泌到培養基中。可以通過使用HiS標簽選擇 程序收獲綴合物（將培養物上清施加到例如His MultiTrap HP板（GE Healthcare)上并 過濾，以此包含His標簽的全部分子結合在基質上（即綴合物）并可以在用適當的洗脫緩 沖液洗滌后洗脫，而全部其他分子將不結合層析材料。
[0227] 可以使用Combimatrix方案產生多特異性結合分子，參見下表。
[0228]
【主權項】
1. 生產包含至少兩個多膚結構域的多膚的方法，所述方法包括步驟為 -培養細胞，所述細胞包含 a) 編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶金黃色葡萄球菌分選酶A的核酸， b) 編碼在其C末端處包含后接內質網駐留信號的分選酶基序的第一多膚結構域的核 酸，和 C)編碼在其N末端處至少包含二甘氨酸的第二多膚結構域的核酸， 由此細胞分泌第一多膚結構域和第二多膚結構域的分選酶A綴合物， 從而生產包含至少兩個多膚結構域的多膚。
2. 生產包含至少兩個結合實體的多特異性結合物的方法，所述方法包括步驟為 -培養細胞，所述細胞包含 a) 編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶金黃色葡萄球菌分選酶A的核酸， b) 編碼在其C末端處包含后接內質網駐留信號的分選酶基序的第一結合實體的核酸， 和 C)編碼在其N末端處至少包含二甘氨酸的第二結合實體的核酸， 由此細胞分泌第一結合實體和第二結合實體的分選酶A綴合物， W此第一結合實體特異性結合第一抗原或祀并且第二結合實體特異性結合第二抗原 或祀， 從而生產包含至少兩個結合實體的多特異性結合物。
3. 選擇特異性結合兩種不同表位或抗原的多特異性結合物的方法，所述方法包括步驟 為 -從包含第一結合實體和第二結合實體的不同組合的多種多特異性結合物中選擇特異 性結合兩種不同表位或抗原的多特異性結合物， 其中多種多特異性結合物的成員每者是通過根據權利要求2的方法獲得的。
4. 根據權利要求3的方法，其特征在于多特異性結合物是基于其結合特異性和/或選 擇性和/或親和力和/或效應子功能和/或體內半壽期選擇的。
5. 根據權利要求2至4中任一項的方法，其特征在于結合實體是抗體重鏈可變結構域 和抗體輕鏈可變結構域的同族對。
6. 根據權利要求2至4中任一項的方法，其特征在于多特異性結合物是包含兩個或四 個結合實體的雙特異性抗體。
7. 根據權利要求1的方法，其特征在于第一多膚結構域和第二多膚結構域彼此獨立地 選自全長抗體、scFv、scF油、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈化區片段、抗體輕鏈可變結構 域和抗體重鏈可變結構域對、VH、VL、CH1、C肥、C冊、CH4、化、抗體較鏈區、細胞因子、受體、 受體配體、可檢測的標簽、標記，和結合對的伙伴。
8. 根據權利要求1至7中任一項的方法，其特征在于內質網駐留信號選自SEQ ID 側：02(邸化）、569 10側：03(皿化）、或569 10側：04 6。1《《《《]\^)。
9. 根據權利要求1至8中任一項的方法，其特征在于分選酶基序是LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸殘基）。
10. 根據權利要求1至9中任一項的方法，其特征在于第一結合結構域或第一結合實體 在20個C末端氨基酸殘基內具有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨 基酸殘基）。
11. 根據權利要求1至10中任一項的方法，其特征在于細胞是哺乳動物細胞或酵母細 胞。
12. 根據權利要求11的方法，其特征在于哺乳動物細胞選自肥K細胞、C冊細胞、或BHK 細胞。
13. 選擇雙特異性抗體的方法，所述方法包括W下步驟 (i) 測定含有細胞的樣品中存在的細胞表面標志物并至少選擇其中第一表面標志物和 第二表面標志物， (ii) 用W下轉染細胞；(a)核酸，其編碼在20個C末端氨基酸殘基內包含氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸殘基）、后接內質網駐留信號K呢L(SEQ ID N0:02)的抗體F油片段，或抗體scF油，或scFv抗體，W此F油片段或scFv抗體特異性結 合第一表面標志物或其配體，（b)核酸，其編碼包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重 鏈化區多膚的單臂抗體片段，W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體 鏈并且其可變結構域對（VH和VL)形成與第二表面標記物或其配體特異性結合的抗原結合 位點，W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區多膚通過形成抗體較鏈區的一個或多個二硫鍵 彼此共價連接，并且W此抗體重鏈化區多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、 或5)氨基酸序列，和（C)編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶金黃色葡萄球菌分選酶A 的核酸， 并從而生產雙特異性抗體。
14. 測定抗原結合位點的組合的方法，所述方法包括W下步驟 (i) 確定通過如下方式制備的多種雙特異性抗體的結合特異性和/或選擇性和/或親 和力和/或效應子功能和/或體內半壽期：組合（a)第一多種抗體Fab片段或scFv抗體片 段的每個成員，W此每個成員在20個C末端氨基酸殘基內包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸殘基）、后接內質網駐留信號邸化(SEQ ID N0:02)，W此 F油片段或scFv抗體與第一表位或抗原特異性結合，與（b)多種包含全長抗體重鏈、全長 抗體輕鏈和抗體重鏈化區多膚的單臂抗體片段的每個成員，W此全長抗體重鏈和全長抗 體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可變結構域對（VH和VL)形成與第二表位或抗原特 異性結合的抗原結合位點，W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區多膚通過形成抗體較鏈區 的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且W此抗體重鏈化區多膚在其N末端具有寡甘氨酸 Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，經由金黃色葡萄球菌分選酶A介導的胞內酶促偶聯 反應， 和 (ii) 選擇具有合適的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應子功能和/或 體內半壽期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結合位點的組合。
15. 通過根據權利要求6至13中任一項的方法獲得的雙特異性抗體。
16. 雙特異性抗體，其在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可 W是任何氨基酸殘基）。
17. 根據權利要求6至13中任一項的方法或根據權利要求15或16中任一項的抗體，其 特征在于化區包含在第329位置處天然存在氨基酸殘基的突變和至少一個氨基酸殘基向 不同殘基的至少一個其他突變，所述至少一個氨基酸殘基選自包含在第228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸殘基的組，其中化區中的殘基根據K油at 的抓索引編號。
18. 藥物制劑，其包含根據權利要求15或權利要求16或權利要求17的雙特異性抗體。
19. 根據權利要求15或權利要求16或權利要求17的雙特異性抗體在制備藥物中的用 途。
【專利摘要】本文報道了生產包含至少兩個多肽結構域的多肽的方法，所述方法包括步驟為培養細胞，所述細胞包含(a)編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶金黃色葡萄球菌分選酶A的核酸，(b)編碼在其C末端處包含后接內質網駐留信號的分選酶基序的第一多肽結構域的核酸，和(c)編碼在其N末端處至少包含二甘氨酸的第二多肽結構域的核酸，由此細胞分泌第一多肽結構域和第二多肽結構域的分選酶A綴合物，從而生產包含至少兩個多肽結構域的多肽。
【IPC分類】C07K1-107
【公開號】CN104619715
【申請號】CN201380047702
【發明人】M·貝克, G·蒂芬塔勒
【申請人】弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2013年9月12日
【公告號】CA2879499A1, EP2895496A1, WO2014041072A1