包含至少兩個不同實體的分子的生產和選擇方法及其用圖
【專利說明】包含至少兩個不同實體的分子的生產和選擇方法及其用途
[0001] 本文報道了通過使用轉肽酶，諸如分選酶A(sortase A)生產和選擇通過兩個不同 實體，諸如結合實體、效應子實體、或有效負荷的組合形成的分子，其中至少兩個不同實體 在體內連接。這是通過將內質網駐留信號（retention signal)添加至分選酶和實體之一 而實現的。
[0002] 發明背景
[0003] 在過去的幾年里，已經開發并臨床測試了多種特異性治療蛋白質，包括細胞表面 受體的抗體、抗體片段和配體。示例性蛋白質是抗體、Fc區綴合物，或靶向遞送載體。已經 將這些治療蛋白質中的一些綴合到若干種類的治療毒素上，如小分子藥物、酶、放射性同位 素、蛋白毒素和用于向患者特定遞送的其他毒素。
[0004] 向疾病位點有效遞送是任何治療分子高效和低毒的前提。例如，抗體可以參與到 該背景中。如果抗體本身不是治療性原理的，那么效應子分子綴合到抗體上使得可以實現 藥物在人體內想要位點上準確定位。這增加了該靶區域內有效藥物的濃度，由此優化活性 劑的治療效力。此外，利用靶向遞送，臨床醫師能夠降低治療劑的總體劑量并因此最小化全 身暴露-如果藥物有效負荷具有相關毒性或如果待用于治療慢性狀況，這是特別相關的事 情（參見例如 McCarron, P. A.，等，Mol. Interventions 5 (2〇〇5) 368_38〇) 〇
[0005] 在WO 2010087994中報道了用于連接的方法及其用途。由Marvin, J. S.，等（Acta Pharmacol. Sinica 26(2005)649-658)報道了 IgG 樣雙特異性抗體的重組方法。Levary, D. A.，等（PLoS one，6(2011)el8342. I_el8342. 6)報道了由分選酶A催化的蛋白質-蛋白 質融合。在WO 2013/003555中報道了分選酶安裝用于蛋白質連接的掣子化學柄（click chemistry handles)的用途。
[0006] Strijbis，K.等（Traffic 13(2012)780-789)報道了使用分選酶在活細胞中的 蛋白質連接。據稱Ca2+-依賴性金黃色葡萄球菌（S. aureus)分選酶A在胞內是非功能性 的，但是Ca2+-非依賴性化膿鏈球菌（S. pyogenes)分選酶A在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和哺乳動物HEK293T細胞的胞質和內質網（ER)腔中均是功能性的。
[0007] 發明概沐
[0008] 本文報道了通過使用金黃色葡萄球菌（S. aureus)的Ca2+-依賴性酶分選酶A來在 胞內體內生產第一多肽結構域與第二多肽結構域的酶催化的（即酶促的）綴合物的方法， 以此多肽結構域之一和可溶分選酶A含有內質網駐留信號。
[0009] 此技術特別適用于快速生成例如，第一組多肽結構域（例如第一組結合結構域諸 如抗體可變結構域的同族對（cognate pair))和第二組多肽結構域（例如第二組結合結構 域諸如抗體可變結構域的同族對，但針對與第一組所針對的不同的表位/抗原，或有效負 荷分子的組）的組合的文庫。此文庫可例如，通過在HEK細胞中瞬時轉染容易地生成，并且 之后可以就例如，預期的生物學效應或預期的性質篩選獲得的組合。
[0010] 如本文報道的一個方面是生產包含至少兩個多肽結構域的多肽的方法，所述方法 包括步驟為
[0011]-培養細胞，所述細胞包含
[0012] a)編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶分選酶A的核酸，
[0013] b)編碼在其C末端處或在其C末端區中包含后接內質網駐留信號的分選酶基序的 第一多肽結構域的核酸，和
[0014] c)編碼在其N末端處包含至少兩個甘氨酸殘基的寡甘氨酸基序的第二多肽結構 域的核酸，
[0015] 由此細胞分泌第一多肽結構域和第二多肽結構域的分選酶A(介導的/催化的） 綴合物，
[0016] 從而生產包含至少兩個多肽結構域的多肽。
[0017] 如本文報道的一個方面是生產包含至少兩個結合實體的多特異性結合物的方法， 所述方法包括步驟為
[0018] -培養細胞，所述細胞包含
[0019] a)編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶分選酶A的核酸，
[0020] b)編碼在其C末端處或在其C末端區中包含后接內質網駐留信號的分選酶基序的 第一結合實體的核酸，和
[0021] C)編碼在其N末端處至少包含二甘氨酸（diglycine)的第二結合實體的核酸，
[0022] 由此細胞分泌第一結合實體和第二結合實體的分選酶A(介導的/催化的）綴合 物，
[0023] 從而第一結合實體特異性結合第一抗原或靶，并且第二結合實體特異性結合第二 抗原或靶，
[0024] 從而生產包含至少兩個結合實體的多特異性結合物。
[0025] 在全部方面的一個實施方案中分選酶A是金黃色葡萄球菌（S. aureus)的分酶A。 在一個實施方案中編碼具有C末端內質網駐留信號的（可溶）分選酶A的核酸編碼SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0026] 本文報道了提供用于在需要治療的患者中治療疾病，如癌癥或病毒感染的定制的 高度特異的治療分子的方法，以此所述治療分子適合患者的疾病特征和/或患者的基因型 /表型。
[0027] 通過考慮患者攜帶疾病/受影響細胞的基因型/表型制備定制分子實現這種適 合。
[0028] 在第一步中，確定旨在利用治療分子靶向的細胞的基因型/表型（疾病特異性細 胞表面分子的存在和數目/數量）。這例如通過細胞成像技術，如使用熒光標記的單特異性 (治療性或診斷性）抗體對來自例如血液和/或活組織檢查材料的患者細胞免疫組織化學 染色（IHC，免疫組織化學）來實現。或者，可以在利用標記的治療或診斷抗體染色后使用基 于FACS的方法分析細胞的基因型/表型。體內成像技術，包括光學成像、分子成像、熒光成 像、生物發光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查也可以用于確定患者的疾病相關 細胞的基因型/表型。根據患者的疾病相關細胞確定的基因型/表型，可以/進行選擇靶 向/結合實體的定制組合，并且組合在治療分子中。該治療分子可以是例如雙特異性抗體。
[0029] 此類定制的治療分子i)將是高度特異的，ii)將具有好的治療功效，并且iii)與 常規選擇的治療劑相比將誘導較少的和/或較不嚴重的副作用。這可以通過提供具有改善 的靶向和/或改善的定制遞送性質，例如對其預期的作用位點遞送治療有效負荷的治療分 子來實現。
[0030] 可以通過與常規選擇的治療分子相比對靶向治療分子的較高的/增加的選擇性 和/或特異性來實現治療分子向其作用位點，如例如癌細胞的改善遞送。治療分子包含至 少兩個實體，其特異性結合或可以被不同蛋白質結合（例如兩種不同的細胞表面標志物）。
[0031] 可以通過兩個靶向實體同時結合其各自的靶標/表位，或通過兩個多肽結構域與 其相互作用伙伴的同時結合，或通過其混合，實現定制治療分子的增加的選擇性和/或特 異性。
[0032] 尤其適合的是對其各自的靶標/表位具有低親和力到中等親和力的兩個結合實 體的組合。此外，脫靶結合被極大地減少或甚至可以被完全消除。
[0033] 已經發現使用本文報道的方法能夠定制例如雙特異性結合物諸如，特異性針對細 胞（諸如癌細胞）表面上發現的兩種表面標志物的雙特異性抗體。由于結合特異性是由 起始組分單獨提供的，能夠簡單地通過確定細胞，例如癌細胞上存在的表面標志物，并通過 酶促流程綴合特異性結合這些表面標志物或其各自配體的各抗體片段，定制多特異性靶向 和結合分子。由于酶促綴合是通過酶分選酶A，在一個實施方案中是通過金黃色葡萄球菌 的分選酶A進行的，獲得的雙特異性結合物（雙特異性抗體）的特征為存在氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）。
[0034] 如本文報道的一個方面是選擇特異性結合兩種不同表位或抗原的多特異性結合 物的方法，所述方法包括步驟為
[0035] -從包含第一結合實體和第二結合實體的不同組合的多種多特異性結合物中選擇 特異性結合兩種不同表位或抗原的多特異性結合物。
[0036] 如本文報道的一個方面是選擇雙特異性抗體的方法，所述方法包括以下步驟
[0037] (i)測定含有細胞的樣品中存在的細胞表面標志物并至少選擇其中第一表面標志 物和第二表面標志物，
[0038] (i i)用以下轉染細胞：(a)核酸，其編碼在20個C末端氨基酸殘基內包含氨基酸 序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）、后接內質網駐留信號KDEL(SEQ ID N0:02)的抗體Fab，或scFab片段，或scFv抗體，以此Fab，或scFab片段，或scFv抗體 特異性結合第一表面標志物或其配體，（b)核酸，其編碼包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈 和抗體重鏈Fc區多肽的單臂抗體片段，以此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的 同族抗體鏈并且其可變結構域對（VH和VL)形成與第二表面標記物或其配體特異性結合的 抗原結合位點，以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fc區多肽通過形成抗體鉸鏈區的一個或多 個二硫鍵彼此共價連接，并且以此抗體重鏈Fc區多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、 或3、或4、或5)氨基酸序列，和（c)編碼具有C末端內質網駐留信號的可溶分選酶A的核 酸，
[0039] 并從而生產雙特異性抗體。
[0040] 如本文報道的一個方面是確定抗原結合位點的組合的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0041] (i)確定通過如下方式制備的多種雙特異性抗體的結合特異性和/或選擇性和/ 或親和力和/或效應子功能和/或體內半壽期：組合（a)第一多種抗體Fab，或scFab片段， 或scFv抗體片段的每個成員，以此每個成員在20個C末端氨基酸殘基內包含氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）、后接內質網駐留信號KDEL(SEQ ID 勵:02)，以此？&13，或8〇?313片段，或8〇?￥抗體與第一表位或抗原特異性結合，與〇3)多種包 含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈Fe區多肽的單臂抗體片段的每個成員，以此全 長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可變結構域對（VH和VL)形成 與第二表位或抗原特異性結合的抗原結合位點，以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fe區多肽 通過形成抗體鉸鏈區的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且以此抗體重鏈Fe區多肽在 其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，通過分選酶A催化的酶促反 應共價連接，
[0042] 和
[0043] (ii)選擇具有合適的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應子功能和 /或體內半壽期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結合位點的組合。
[0044] 在全部方面的一個實施方案中分選酶A是金黃色葡萄球菌（S. aureus)的分選酶 A。在一個實施方案中編碼（可溶的）具有C末端內質網駐留信號的分選酶A的核酸編碼 SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0045] 如本文報道的一個方面是通過本文報道的方法獲得的雙特異性抗體。
[0046] 如本文報道的一個方面是在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01， 其中X可以是任何氨基酸殘基）的雙特異性抗體。