止培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液離心后棄上清，收集 菌體，稱重后將菌體重懸于20-30ml pH 6. 2磷酸鹽緩沖液中，至體系的OD6cJ直為300-500。
[0035] 其中，pH 6. 2磷酸緩沖液的配方為：100mL體系中含19. 2mL 0. lmol/L K2HPO4, 80. 8mL 0.1mol/L KH2PO4。后文涉及到的"pH 6. 2磷酸緩沖液"的配方均與此相同。
[0036] 2、菌體的固定
[0037] 選擇海藻酸鈉，結(jié)冷膠，卡拉膠三種固定化試劑。
[0038] (1)海藻酸鈉
[0039] 按照固定化試劑：菌體=0. 18g :1. 62X IO6Cfu的比例進(jìn)行菌體固定化。具體如 下：
[0040] 將海藻酸鈉溶于8ml超純水中加熱使其完全溶解，冷卻后與Iml步驟1所 得菌液混合均勻，使得海藻酸鈉在整個體系中的終濃度為2g/100ml，菌體的終濃度 為1.8±0. 7X108cfu/L。將所得海藻酸鈉菌液混合物使用注射器注入到濃度為2% (2g/100ml)的CaCl 2水溶液中形成均一球狀顆粒（粒徑為L 38±0· 03mm)。
[0041] ⑵結(jié)冷膠
[0042] 按照固定化試劑：菌體=0. 09g :1. 62X IO6Cfu的比例進(jìn)行菌體固定化。具體如 下：
[0043] 將結(jié)冷膠溶于8ml超純水中加熱使其完全溶解，冷卻至50°C后與Iml步驟1所 得菌液混合均勻，使得結(jié)冷膠在整個體系中的終濃度為1 % (lg/l〇〇ml)，菌體的終濃度為 1.8±0. 7X108cfu/L。將結(jié)冷膠菌液混合物使用注射器注入到濃度為2% (2g/100ml)的 CaCl2水溶液中形成均一球狀顆粒（粒徑為2. 02 ±0. 30mm)。
[0044] (3)卡拉膠
[0045] 按照固定化試劑：菌體=0. 18g :1. 62X IO6Cfu的比例進(jìn)行菌體固定化。具體如 下：
[0046] 將卡拉膠溶于8ml超純水中加熱使其完全溶解，冷卻后與Iml步驟1所得菌液混合 均勻，使得卡拉膠在整個體系中的終濃度為2g/100ml，菌體的終濃度為1. 8 ±0. 7 X IO8Cfu/ L。待卡拉膠菌液混合物凝固后切成大小均一的膠粒（粒徑I. 90±0. 02mm)，在濃度為3% (3g/100ml)的KCl水溶液中固定2h。
[0047] 3、利用固定化菌體生產(chǎn)羅伊氏素
[0048] (1)生產(chǎn)羅伊氏素的反應(yīng)
[0049] 分別收集步驟2獲得的3種膠粒，采用超純水洗去表面離子，按照如下進(jìn)行反應(yīng)：
[0050] 反應(yīng)體系的配制：向濃度為200mmol/L的甘油溶液（溶劑為pH 6. 2磷酸緩沖液） 中加入若干膠粒，使羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)CGMCC No. L 3264在整個反應(yīng) 體系中的終濃度為1.8±0. 7X108cfu/L。
[0051] 反應(yīng)條件：30°C條件下靜置反應(yīng)2h，反應(yīng)初始pH為6. 2。
[0052] 實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0053] (2)反應(yīng)液中羅伊氏素含量的測定
[0054] 由于羅伊氏素的主要成分為3-HPA，本領(lǐng)域中公認(rèn)采用3-HPA的產(chǎn)量來衡量羅伊 氏素的產(chǎn)量。
[0055] 反應(yīng)結(jié)束后，將三種固定化試劑和游離菌體反應(yīng)液過濾，按照如下方法測定濾液 中3-HPA產(chǎn)量的含量：
[0056] A.通過比色法測定反應(yīng)體系中3-羥基丙醛（3-HPA)的濃度：配制丙烯醛標(biāo)準(zhǔn)品 (FLUKA 公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為 SIAL-89116-1ML)濃度 0. 5mmol/L、lmmol/L、l. 5mmol/L、 2mmol/L、2. 5mmol/L、3mmol/L、3· 5mmol/L、4mmol/L、4· 5mmol/L、5mmol/L (溶劑為水）。色 氨酸溶于〇. 〇5mmol/L HCl至終濃度為10mm〇l/L。取不同濃度的ImL丙烯醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 0. 75mL色氨酸溶液，3mL濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37% )，37°C條件下反應(yīng)20min。OD56tlmi條件 下測定吸光度值，以丙烯醛標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X)，以O(shè)D 56tol為縱坐標(biāo)（y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0057] B.以待測的三種固定化試劑或游離菌體反應(yīng)液的過濾液替代步驟A中的丙烯醛 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余按照步驟A的操作進(jìn)行，測定OD 56tol，將所得OD56tlnm代入步驟A獲得的標(biāo)準(zhǔn) 曲線方程中，計算得到丙烯醛的含量（單位 ：mm〇l/L)。由于丙烯醛與3-HPA按照1:1的摩 爾比轉(zhuǎn)化，因此，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得丙烯醛的含量即可表示3-HPA的含量。
[0058] (3)反應(yīng)前后3-HPA/甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率的測定
[0059] 3-HPA/甘油的摩爾轉(zhuǎn)化率（％ )為反應(yīng)后反應(yīng)體系中3-HPA含量與反應(yīng)前總甘油 的含量的比值。其測定方法具體如下：
[0060] 甘油的含量使用安捷倫高效液相色譜儀按照下述條件測定：AminexHPX-87H有機(jī) 酸柱，流動相為6mmol/L H2SO4，流速為0. 8mL/min，柱溫60°C，溫示差檢測器（RID) 35°C。
[0061] 4、結(jié)果
[0062] 結(jié)果顯示，卡拉膠是最佳固定化試劑，3-HPA的產(chǎn)量為125. 2mmol/L，3-HPA/甘油 的摩爾轉(zhuǎn)化率為62. 9%，顯著高于以海藻酸鈉或結(jié)冷膠為固定化試劑組的3-HPA的產(chǎn)量 (P〈0. 05)。詳細(xì)結(jié)果參見表1 (三次以上重復(fù)實驗的測定結(jié)果）。
[0063] 表1三種固定化試劑及游離菌體的3-HPA產(chǎn)量
[0064]
【主權(quán)項】
1. 一種生產(chǎn)羅伊氏素的方法，包括如下步驟： (1) 采用含有磁性納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進(jìn)行固定，得到固定有所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的膠粒； (2) 配制含有所述膠粒的反應(yīng)體系，將所述反應(yīng)體系于30°C靜置反應(yīng)2h，從反應(yīng)液中 獲得羅伊氏素； 在所述反應(yīng)體系中，含有濃度為200-250mmol/L的甘油。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述采用含有磁性納米顆 粒和卡拉膠的混合物對羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進(jìn)行固定的方法包括如 下步驟：制備含有所述磁性納米顆粒、所述卡拉膠和所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的固定體系； 所述磁性納米顆粒在所述固定體系中濃度為9g/L ; 所述磁性納米顆粒為經(jīng)PEG修飾的Fe304納米顆粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述卡拉膠在所述固定體系中濃度為 20g/L〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillusreuteri)在所述固定體系中含量為 1.8±0.7X108cfu/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述采用含有磁性 納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進(jìn)行固定的方法， 在配制完所述固定體系后還包括如下步驟：待所述固定體系凝固后切割成膠粒，置于30g/ L的KC1水溶液中浸泡2h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步驟⑵中，所述反應(yīng)體系中還 含有Mg2+、維生素B 12和葡萄糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述Mg 2+在所述反應(yīng)體系中的濃度為 10mmol/L ;和 / 或 所述維生素B12在所述反應(yīng)體系中的濃度為0. 02g/L ;和/或 所述葡萄糖在所述反應(yīng)體系中的濃度為37. 5mmol/L ;和/或 所述膠粒在所述反應(yīng)體系中的含量為1.8±0.7X108cfu/L，以所述羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)的計。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，被固定的所述羅伊 氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)是采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后得到的；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的 溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為：酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，檸檬酸銨2. 4g/L，醋酸鈉6.2g/L，磷 酸氫二鉀1. 8g/L，硫酸錳0? 16g/L，硫酸鎂0? 21g/L，吐溫800. 8g/L。
9. 一種用于生產(chǎn)羅伊氏素的試劑盒，含有權(quán)利要求1-8中任一所述膠粒、羅伊氏乳桿 菌（Lactobacillus reuteri)和甘油。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法或權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于： 所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri) CGMCC No. 1. 3264。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用固定化細(xì)菌生產(chǎn)羅伊氏素的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)羅伊氏素的方法，包括如下步驟：(1)采用磁性納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)進(jìn)行固定，得到固定有所述羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的膠粒；(2)配制含有步驟(1)所得膠粒的反應(yīng)體系，將所述反應(yīng)體系于30℃靜置反應(yīng)2h，從反應(yīng)液中獲得羅伊氏素；在所述反應(yīng)體系中，含有濃度為200-250mmol/L的甘油。該方法與傳統(tǒng)方法相比，提高了甘油的轉(zhuǎn)化率，大幅提升了羅伊氏素的產(chǎn)量。另外，本發(fā)明所采利用菌株為生物安全菌株，可直接用于食品領(lǐng)域；并且利用該方法制備的細(xì)胞催化劑具有磁性，可以很方便的從水相中分離菌體，便于羅伊氏素的純化，固定化的細(xì)胞催化劑可以重復(fù)利用，降低了成本。
【IPC分類】C12P7-42, C12R1-225
【公開號】CN104611384
【申請?zhí)枴緾N201510032747
【發(fā)明人】劉菲霞, 于波
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月22日