一種利用固定化細菌生產羅伊氏素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用固定化細菌生產羅伊氏素的方法。
【背景技術】
[0002] 羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)常棲息于人和動物的腸道系統中，對人 和動物無害，具有良好的生物相容性。它代謝甘油產生一種特殊的抑菌物質一一羅伊氏素 (reuterin)。羅伊氏素是一種廣譜抗菌劑，可抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉 菌、病原蟲、原生動物等的生長，不僅可以有效作用于細菌，同樣也可以作用于某些真菌和 原生動物。羅伊氏素的主要成分是3-羥基丙醛（3-HPA)的單體、水合物和環化二聚體。除 了抗菌外，3-HPA單體還是一種潛在的重要化工原料，可作為多種新興化學品如丙烯醛、丙 烯酸、1，3-丙二醇等的前體，用于制備新型聚合物材料；可和蛋白質中的氨基反應形成交 聯，有望取代化學合成的戊二醛和環氧化合物作為新型生物交聯劑。
[0003] 磁性納米離子具有超順磁性，低毒性以及生物相容性等優點，近年來，越來越多的 被應用在藥物靶向運輸，環境修復以及磁流體等研宄領域。PEG是一種親水性的生物相容性 化合物，PEG修飾后的磁性納米離子不僅可以減少其生物毒性也能防止Fe 3O4被氧化。
[0004] 相對于游離細胞來說，固定化細胞減少了氧氣的傳遞，利于厭氧反應的進行。磁性 納米離子具有大的比表面積以及超順磁性，既可以解決傳統固定化細胞反應中物質運輸困 難的問題還促進了細胞的重新利用。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種利用固定化細菌生產羅伊氏素的方法。
[0006] 本發明所提供的生產羅伊氏素的方法，具體可包括如下步驟：
[0007] (1)采用含有磁性納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進行固定，得到固定有所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的膠粒；
[0008] (2)配制含有步驟（1)所得膠粒的反應體系，將所述反應體系于30°C靜置反應2h， 從反應液中獲得羅伊氏素；
[0009] 在所述反應體系中，含有終濃度為200-250mmol/L (如250mmol/L)的甘油。
[0010] 在所述方法的步驟（1)中，所述采用含有磁性納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊 氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進行固定的方法包括如下步驟：制備含有所述磁性納 米顆粒、所述卡拉膠和所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的固定體系。
[0011] 所述磁性納米顆粒在所述固定體系中終濃度具體為9g/L。在本發明中，所述磁 性納米顆粒具體為經PEG修飾的Fe 3O4納米顆粒。所述卡拉膠在所述固定體系中濃度具體 為20g/L。所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)在所述固定體系中含量具體為 1. 8±0· 7X108cfu/L。
[0012] 在本發明中，每9ml所述固定體系的組成如下：8ml水（超純水）、81mg所述經 PEG修飾的Fe3O4納米顆粒、180mg所述卡拉膠、I. 62±0. 7X 10 6cfu所述羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)，余量為 pH 6.2 磷酸緩沖液。
[0013] 在本發明中，所述經PEG修飾的Fe3O4納米顆粒中的PEG具體為PEG-1000。在所 述經PEG修飾的Fe 3O4納米顆粒的制備過程中，所述Fe 304與PEG的配比為0. 29g : lg。
[0014] 更加具體的，所述經PEG修飾的Fe3O4納米顆粒具體是按照包括如下步驟的方法制 備得到的：（al)將Fe 3+(如氯化鐵、硫酸鐵或硝酸鐵）和Fe2+(如氯化亞鐵、硫酸亞鐵或硝酸 亞鐵）按照摩爾比為3:2的比例混合后調節pH至10 (如采用氨水進行pH調節），60°C磁 力攪拌15min。（a2)加入PEG-1000, PEG-1000的加入量與步驟（al)中Fe3+的配比為12g PEG-1000:0. 015mol Fe3+，攪拌反應lh。（a3)反應后，水洗至pH恒定。（a4)使用梯度離心 的方法，先使用IOOOrpm的轉速除去大顆粒雜質，在使用8000rpm-10000rpm的轉速除去小 顆粒雜質，直接得到均勻懸濁液，即為所述經PEG修飾的Fe 3O4納米顆粒。
[0015] 在所述方法的步驟（1)中，所述采用含有磁性納米顆粒和卡拉膠的混合物對羅伊 氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)進行固定的方法，在配制完所述固定體系后還包括如 下步驟：待所述固定體系凝固后切割成膠粒，置于30g/L的KCl水溶液中浸泡2h，從而完成 對所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的固定。
[0016] 在所述方法的步驟（2)中，所述反應體系中還可含有Mg2+(如MgSO 4)、維生素 B12和 葡萄糖。
[0017] 在本發明中，所述Mg2+(如MgSO4)在所述反應體系中的終濃度具體為lOmmol/L ; 所述維生素 B12在所述反應體系中的終濃度具體為0. 02g/L ;所述甘油在所述反應體系中的 終濃度具體為250mmol/L ;所述葡萄糖在所述反應體系中的終濃度具體為37. 5mmol/L ;所 述固定有所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的膠粒在所述反應體系中的含量為 1. 8±0· 7X 108cfu/L(以所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的量計）。
[0018] 在所述方法的步驟（2)中，所述反應體系的液體環境具體可為PH6. 2磷酸緩沖液。 其中，所述pH 6. 2磷酸緩沖液的組成如下：每IOOmL所述pH 6. 2磷酸緩沖液中含19. 2mL 0. lmol/L K2HPO4,80. 8mL 0. lmol/L KH2PO40
[0019] 在本發明的一個實施例中，所述反應體系組成具體如下：每IL所述反應體 系中含有 IOmmol Mg2+(如 MgSO4)、0. 02g 維生素 B12、250mmol 甘油、37. 5mmol 葡萄糖、 1. 8±0.7X IO8Cfu所述固定有所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的膠粒（以所 述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)的量計）；余量為所述pH6. 2磷酸緩沖液。
[0020] 在所述方法的步驟⑴中，被固定的所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)是采用發酵培養基培養后得到的；所述發酵培養基的溶劑為水，溶質及濃度為： 酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，檸檬酸銨2. 4g/L，醋酸鈉6. 2g/L，磷酸氫二鉀I. 8g/L，硫酸錳 0. 16g/L，硫酸鎂0. 21g/L，吐溫800. 8g/L ;pH 6. 3。進一步，采用所述發酵培養基進行培養 的溫度為40 °C。
[0021] 本發明的另一個目的是提供一種用于生產羅伊氏素的試劑盒。
[0022] 本發明所提供的用于生產羅伊氏素的試劑盒，含有所述膠粒、所述羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)、甘油；當然還可含有記載有前文所述方法的說明書。
[0023] 在本發明中，以上所有所述羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)均具體為羅 伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)CGMCC No. 1.3264。
[0024] 實驗證明，采用本發明所提供的方法，利用固定化細菌生產羅伊氏素與傳統方 法利用游離細菌生產羅伊氏素相比，本發明的方法顯著提高了作為底物的甘油的轉化 率，使羅伊氏素的產量得到大幅度提升。另外，本發明所采利用菌株一一羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)為生物安全菌株，可直接用于食品領域；并且利用該方法制備的 細胞催化劑具有磁性，可以很方便的從水相中分離菌體，便于羅伊氏素的純化，固定化的細 胞催化劑可以重復利用，降低了成本。
【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0026] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027] 羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri):購自中國普通微生物菌種保藏管理中 心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏編號為 1. 3264。
[0028] 實施例1、發酵培養基及培養條件優化
[0029] 運用響應面分析法（response surface methodology RSM)中 Plackett-Burman 設計選出對響應值影響較大的因素，然后采用BOX-Benhnken design(BBD)進行實驗，通過 實驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優實驗條件，進行驗證實驗。其中，以菌體 的〇D_為響應指標，培養基配方中所有指標，以及培養溫度都進行優化，實驗的設計主要是 用design expert軟件完成。
[0030] 最終確定最優發酵培養基的配方如下：酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，梓檬酸按 2. 4g/L，醋酸鈉6. 2g/L，磷酸氫二鉀I. 8g/L，硫酸錳0· 16g/L，硫酸鎂0· 21g/L，吐溫800. 8g/ L，pH 6. 3。最優培養溫度為40°C。
[0031] 實驗驗證，采用如上確定的最優發酵培養基（初始pH6. 3)于40°C靜止培養羅伊氏 乳桿菌（Lactobacillus reuteri)CGMCC No. L 3264,菌體最大生長量可達為 0D_= 13. 2〇
[0032] 實施例2、固定化試劑優化
[0033] 1、待固定菌體的準備
[0034] 將羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri) CGMCC No. L 3264接種于實施例1確 定的最優發酵培養基（初始PH6. 3)中，于40°C靜