R反應體系為：PCR Mix 25 μ L， 10 ymol/LPCR引物上、下游引物各I. 5 yL，模板2 yL，滅菌水20 yL。
[0060] 所述 PCR 反應條件為：95 °C 5min ;95 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 60s，30 個循環； 72°C 4min〇
[0061] 所述提取雞羽毛中的DNA步驟為：所述羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出 的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的絨羽，羽毛剪碎后放入2mL離心管中，每個樣品加入裂解液 1000 μ L及蛋白酶K 40 μ L搖勻，放搖床內59°C水浴消化；消化充分后，加700-800uL飽和 酷，搖勾IOmin后以轉速IOOOOrpm離心5min ;
[0062] 吸取上清液放入2mL離心管中，加 IOOOuL飽和酚，搖勻5min后以轉速IOOOOrpm 離心5min ;
[0063] 吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勻5min后以轉速IOOOOrpm離心 5min ；
[0064] 吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇， 再把DNA團塊用70%的酒精洗一遍，以轉速IOOOOrpm離心IOmin ;倒掉乙醇，留下DNA，涼 干lh，加滅菌水IOOuL溶解，放-20°C冰箱保存。
[0065] 所述對測序獲得序列進行拼接步驟為：將步驟3所述測序獲得序列經DNAStar 5. 02軟件的SeqMan程序拼接，將拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列NC_007235進行 比對，剪掉引物及多余的序列，獲得雞mtDNA Cytb基因全長。
[0066] 實施例1絲羽烏骨雞系統進化及遺傳多樣性的研宄
[0067] LI DNA樣本制備
[0068] 采集30只絲羽烏骨雞頸部換羽后剛長出的羽毛，公母各半，隨機取樣。用剪刀剪 掉羽根上部的絨羽，在干凈的PE手套上剪碎后，放入2mL離心管中，每個樣品加入裂解液 1000 μ L及蛋白酶K 40 μ L搖勻，放搖床內59°C水浴消化。消化充分后，加700-800uL飽和 酚，搖勻IOmin后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加 IOOOuL飽和 酷，搖勾5min后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL， 搖勻5min后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀 出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA團塊用70%的酒精洗一遍，以轉速IOOOOrpm離心 10min。倒掉乙醇，留下DNA，涼干（Ih)，加滅菌水IOOuL溶解，放-20°C冰箱保存。
[0069] 1.2 5個亞種紅色原雞Cytb基因全序列下載
[0070] 從GenBank數據庫中下載紅色原雞5個亞種Gallus galIus bankiva、Gallus galIus gallus、 Gallus gallus murghi、 Gallus galIus jabouillei、 Gallus galIus spadiceus等已經測出mtDNA Cytb基因全序列的序列，與絲羽烏骨雞進行系統發育分析。
[0071] 1.3 PCR 擴增
[0072] PCR擴增體系（50 μ L) !PCRMix (南京博爾迪公司）25 μ L，10 μ mol/L引物各 I. 5 μ L，模板 2 μ L，滅菌水 20 μ L。反應程序為：95°C 5min，（95°C 30s，56°C 60s，72°C 60s) 30 循環，72°C 4min。I. 5%低溶點瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測PCR產物，用試劑盒 (Promega公司）回收純化。純化后連同正向引物和步移引物一起送測序公司測序。
[0073] I. 4序列組裝和分析
[0074] 測序獲得序列用DNAStar 5. 02軟件的SeqMan程序拼接，將拼接序列與GenBank 中紅色原雞參考序列NC_007235進行比對，剪掉引物及多余的序列，獲得雞mtDNA Cytb基 因全長。。用DnaSP version 5. 10軟件統計多態位點數和突變位點總數，單倍型數，單倍型 多樣度，核苷酸多樣度等。用MEGA 4.0進行轉換與顛換數目的統計和堿基組成分析，并用 其采用鄰接法構建系統發育樹，發育樹選用Kimura 2模型，1000次重復。
[0075] 本發明是結合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發明的上述內容后，本領 域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求 書所限定的范圍。
【主權項】
1. 雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序用引物，其特征在于，包括PCR引物和測序 引物，所述PCR引物的上游引物為：5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引物為： 5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3' ； 所述測序引物為 Walking primer :5'-CGCCTTTGTGGGCTATGIT-3'。
2. -種雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量； (2) 在雞mtDNA Cyt b基因上下游保守區域設計一對權利要求1所述的PCR引物，通過 PCR反應擴增包含Cytb基因的片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測； (3) 利用權利要求1所述的測序引物對PCR擴增產物進行測序； (4) 對測序獲得序列進行拼接，并減掉上下游多余的序列，獲得雞mtDNA Cyt b基因全 序列，雞mtDNA Cyt b基因全長為1143bp。
3. 根據權利要求2所述的雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及其測序方法，其特征在 于，所述用于擴增雞mtDNA Cyt b基因全序列的PCR反應體系為：PCR Mix 25 yL，10 y mol/ LPCR引物上、下游引物各1. 5 y L，模板2 y L，滅菌水20 y L。
4. 根據權利要求2或3所述的雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及其測序方法，其特征 在于，所述PCR反應條件為：95°C 5min ;95°C 30s，56°C 30s，72°C 60s，30個循環；72°C 4min。
5. 根據權利要求2所述的雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及其測序方法，其特征在 于，所述提取雞羽毛中的DNA步驟為：所述羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出的羽毛 2-3根，剪掉羽根上部的絨羽，羽毛剪碎后放入2mL離心管中，每個樣品加入裂解液1000 y L 及蛋白酶K 40 y L搖勻，放搖床內59°C水浴消化；消化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻 lOmin后以轉速lOOOOrpm離心5min ; 吸取上清液放入2mL離心管中，加1000uL飽和酚，搖勻5min后以轉速lOOOOrpm離心 5min ； 吸取上清液放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勻5min后以轉速lOOOOrpm離心 5min ； 吸取上清液放入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇，再把 DNA團塊用70%的酒精洗一遍，以轉速lOOOOrpm離心lOmin ;倒掉乙醇，留下DNA，涼干lh， 加滅菌水100uL溶解，放-20°C冰箱保存。
6. 根據權利要求2所述的雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及其測序方法，其特 征在于，步驟（4)中所述對測序獲得序列進行拼接步驟為：將步驟3所述測序獲得序列 用DNAStar5. 02軟件的SeqMan程序拼接，將拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列 NC_007235進行比對，剪掉引物及多余的序列，獲得雞mtDNA Cytb基因全長。
7. 根據權利要求2所述的雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及其測序方法，其特征是， 測序獲得包含mtDNA Cytb基因全長及上游和下游部分序列的1490bp的特異性擴增條帶的 核苷酸序列為： TCTTACCTGG GTTCTTTCGC CCTCACAATC CTTACAACGA TCCTACTTAT CCAAAAATAA 60 ACTAatggca cccaacattc gaaaatccca ccccctacta aaaataatta acaactccct 120 aatcgacctc ccagccccat ccaacatctc tgcttgatga aatttcggct ccctattagc 180 agtctgcctc atgacccaaa tcctcaccgg cctactacta gccatgcact acacagcaga 240 cacatcccta gccttctcct ccgtagccca cacttgccgg aacgtacaat acggctgact 300 catccggaat ctccacgcaa acggcgcctc attcttcttc atctgtatct tccttcacat 360 cggacgaggc ctatactacg gctcctacct ctacaaagaa acctgaaaca caggagtaat 420 cctcctcctc acactcatag ccaccgcctt tgtgggctat gttctcccat ggggccaaat 480 atcattctga ggggccaccg ttatcacaaa cctattctca gcaattccct acattggaca 540 caccctagta gagtgagect gaggaggatt ctcagtcgac aacccaaccc ttacccgatt 600 cttcgcctta cacttcctcc tcccctttgc aatcgcaggt attactatca tccacctcac 660 cttcctacac gaatcaggct caaacaaccc cctaggcatc tcatccgact ctgacaaaat 720 tccatttcac ccatactact ccttcaaaga cattctgggc ttaactctca tactcacccc 780 attcctaaca ctagccctat tctcccccaa cctcctagga gacccagaaa acttcacccc 840 agcaaaccca ctagtaaccc ccccacatat caaaccagaa tgatattttc tattcgccta 900 tgccatccta cgctccatcc ccaacaaact tggaggtgta ctagccctag cagcctcagt 960 cctcatcctc ttcctaatcc ccttcctcca caaatctaaa caacgaacaa taaccttccg 1020 accactctcc caaaccctat tetgaettet agtagccaac cttcttatcc taacctgaat 1080 cggaagccaa ccagtagaac accccttcat catcattggc caaatagcat ccctctctta 1140 cttcaccatc ctacttatcc tcttccccac aatcggaaca ctagaaaaca aaatactcaa 1200 ctactaaAAT ACTCTAATAG TTTATGAAAA ACATTGGTCT TGTAAACCAA AAACTGAAGA 1260 CTCCACCCTT CTTAGAGTAT CAGAAAAGGA GGACTCAAAC CTCCATCTCC AGCTCCCAAA 1320 GCTGGTATTT TCAAATAAAC TACTCTCTGA AACCCTTAAA CCGCCCGAAT TGCCCCCCGA 1380 GACAACCCAC GCACAAGCTC TAGTACAACA AACAAAGCTA ACAACAAACC TCACCCAGCC 1440 ACCAAAAACA ACCCAACCCC ACATGAATAA AACACCGCAA CTCCACTAAA 1490。
【專利摘要】本發明公開了一種雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序方法和專用引物。雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序用引物，見序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。擴增及其測序方法，包括以下步驟：（1）提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量；（2）在雞mtDNA Cyt b基因基因上下游保守區域設計一對所述PCR引物（SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2）；（3）利用測序引物（SEQ ID NO.3）對PCR產物進行測序；（4）對測序序列進行拼接。本發明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優點，所獲得的mtDNA Cytb基因全序列可以應用于雞遺傳資源多樣性評估、母系起源、系統進化分析和種質資源鑒定與保護等多個領域。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-10, C12N15-11
【公開號】CN104611327
【申請號】CN201410835923
【發明人】高玉時, 賈曉旭, 唐修君, 陸俊賢, 唐夢君, 張靜, 馬麗娜, 樊艷鳳
【申請人】江蘇省家禽科學研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月29日