雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序方法和專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種雞mtDNA Cytb基因全序列擴增及 其測序方法。
【背景技術】
[0002] 動物遺傳資源多樣性能夠為品種改良提供素材，并且能夠很好適應環境的變化。 我國有豐富家禽地方品種資源，研宄和評估我國家禽地方品種的遺傳多樣性，制定合理的 利用和保護措施對我國畜牧業的可持續發展具有重要意義。研宄動物遺傳多樣性的方法主 要有微衛星和線粒體DNA等，兩種方法各有優缺點，線粒體DNA更容易操作。畜（禽）品種 大都受到外來公畜（禽）雜交改良的影響，群體數量減少甚至消失，給研宄品種起源和多樣 性帶來很大困難。線粒體DNA在遺傳過程中，遺傳物質通過卵細胞質傳遞，較少發生DNA重 組，其野生祖先的線粒體DNA類型一般能得以保持。這種遺傳方式，一個個體就能代表一個 母性集團，因此只需少量個體樣本便能反映一個群體的遺傳結構。研宄者可以從復雜的遺 傳背景中分辨不連續的母系血統，即使經過幾千年的雜交繁育，系統關系依然明晰。
[0003] 雞線粒體基因組一般在16785bp左右，為閉合環狀雙鏈結構，能夠自主復制和轉 錄。包括37個基因的編碼編碼區（13個蛋白質編碼基因、2個核糖體RNA基因、22個轉運 RNA基因）和1個控制區。細胞色素 b (Cyt b)基因是mt DNA 13個蛋白質編碼基因中結構 和功能了解的最為清楚的一個，也是編碼蛋白質唯一位于線粒體基區的。細胞色素 MCyt b)基因進化速率適中，從科間到種間，乃至種內具有豐富的多態性，是研宄種間和種內遺傳 分化程度及系統進化的理想的分子標記。Cyt b基因部分或者全部序列已經廣泛地應用于 動物類群的遺傳多樣和系統進化研宄中，全序列包含的遺傳信息更為豐富。由于Cyt b基 因下游為tRNA-Thr基因（69bp)、tRNA-Pro基因（70bp)，折疊成三葉草形的短鏈，較正常的 核苷酸結構測序困難，一般反向測序都難以成功。目前還沒有運用Cyt b基因全序列對我 國家禽地方品種進行系統的研宄，因此建立Cyt b基因全序列擴增和測序方法是十分必要 的。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提出一種雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序方法和專用 引物，本發明速度快、成本低、易于掌握，能夠有效檢測出雞的mtDNA Cytb基因全序列。
[0005] 本發明提供了一種雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序用引物，包括PCR引物 和測序引物，所述PCR引物的上游引物為：5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引 *S:5'-ITTAGTGGAGTTGCGGTGT-3' ；
[0006] 所述測序引物為 Walking primer :5' -CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。
[0007] 本發明還提供了一種雞mtDNA Cytb基因全序列擴增及其測序方法，包括以下步 驟：
[0008] (1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量；
[0009] (2)根據紅色原雞mtDNA Cytb基因在mtDNA全基因組序列上的相對位置，在mtDNA Cytb基因上下游保守區域設計一對PCR引物，引物序列為：
[0010] Forward prime(SEQ ID NO. 1):5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'
[0011] Reverse primer(SEQ ID NO. 2):5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'
[0012] (3) PCR產物測序與序列拼接
[0013] 通過PCR反應，獲得目的片段，純化后送測序公司測序，由于mtDNA Cytb基因下游 結構復雜，反向引物無法測出，根據正向引物已測出的mtDNA Cytb基因序列設計一條測序 引物，進行引物步移（Primer walking)測序，讓后將正向引物和步移引物測得兩條序列進 行拼接，獲得mtDNA Cytb基因全序列。
[0014] Walking primer(SEQ ID NO. 3)5,-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'
[0015] 步驟1中雞羽毛中DNA的提取步驟為：羽毛樣采集雛雞或者成雞換羽后剛長出的 羽毛，一般為2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的絨羽，在干凈的PE手套上剪碎后，放入2mL離 心管中，每個樣品加入裂解液1000 yL及蛋白酶K 40 yL搖勻，放搖床內59°C水浴消化。消 化充分后，加700-800uL飽和酚，搖勻IOmin后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液放 入2mL離心管中，加 IOOOuL飽和酚，搖勻5min后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液 放入2mL離心管中，加氯仿1000uL，搖勾5min后以轉速IOOOOrpm離心5min。吸取上清液放 入2mL離心管中，加無水乙醇沉淀出DNA團塊，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA團塊用70%的 酒精洗一遍，以轉速IOOOOrpm離心10min。倒掉乙醇，留下DNA，涼干（Ih)，加滅菌水IOOuL 溶解，放_20°C冰箱保存。
[0016] 步驟 3 中 PCR 反應體系為：PCR Mix 25 μ L，10 μ mol/L 引物各 1.5 μ L，模板 2 μ L， 滅菌水20 μ L。
[0017] 步驟 3 中 PCR 反應程序為：95°C 5min，（95°C 30s，56°C 30s，72°C 60s)30 循環， 72°C 4min〇
[0018] 步驟3中所述mtDNA Cytb拼接方法為：測序獲得序列用DNAStar 5. 02軟件的 SeqMan程序拼接，將拼接序列與GenBank中紅色原雞參考序列NC_007235進行比對，剪掉引 物及多余的序列。
[0019] 上述的方法，所述PCR擴增特異性條帶為1490bp，包含mtDNA Cytb基因全序列及 上下游部分序列，其核苷酸序列為：（小寫字母表示Cytb基因全長序列，大寫字母表示上游 和下游序列，黑色下劃線表示上下游引物位置，陰影部分表示步移引物位置）：
[0020] TCTTACCTGG GTTCTTTCGC CCTCACAATC CTTACAACGA TCCTACTTAT CCAAAAATAA 60
[0021] ACTAatggca cccaacattc gaaaatccca ccccctacta aaaataatta acaactccct 120
[0022] aatcgacctc ccagccccat ccaacatctc tgcttgatga aatttcggct ccctattagc 180
[0023] agtctgcctc atgacccaaa tcctcaccgg cctactacta gccatgcact acacagcaga 240
[0024] cacatcccta gccttctcct ccgtagccca cacttgccgg aacgtacaat acggctgact 300
[0025] catccggaat ctccacgcaa acggcgcctc attcttcttc atctgtatct tccttcacat 360
[0026] cggacgaggc ctatactacg gctcctacct ctacaaagaa acctgaaaca caggagtaat 420
[0027] cctcctcctc acactcatag ccac ：cgccn tgigggcuu gtu ctcccat ggggccaaat 480
[0028] atcattctga ggggccaccg ttatcacaaa cctattctca gcaattccct acattggaca 540
[0029] caccctagta gagtgagcct gaggaggatt ctcagtcgac aacccaaccc ttacccgatt 600
[0030] cttcgcctta cacttcctcc tcccctttgc aatcgcaggt attactatca tccacctcac 660
[0031] cttcctacac gaatcaggct caaacaaccc cctaggcatc tcatccgact ctgacaaaat 720
[0032] tccatttcac ccatactact ccttcaaaga cattctgggc ttaactctca tactcacccc 780
[0033] attcctaaca ctagccctat tctcccccaa cctcctagga gacccagaaa acttcacccc 840
[0034] agcaaaccca ctagtaaccc ccccacatat caaaccagaa tgatattttc tattcgccta 900
[0035] tgccatccta cgctccatcc ccaacaaact tggaggtgta ctagccctag cagcctcagt 960
[0036] cctcatcctc ttcctaatcc ccttcctcca caaatctaaa caacgaacaa taaccttccg 1020
[0037] accactctcc caaaccctat tctgacttct agtagccaac cttcttatcc taacctgaat 1080
[0038] cggaagccaa ccagtagaac accccttcat catcattggc caaatagcat ccctctctta 1140
[0039] cttcaccatc ctacttatcc tcttccccac aatcggaaca ctagaaaaca aaatactcaa 1200
[0040] ctactaaAAT ACTCTAATAG TTTATGAAAA ACATTGGTCT TGTAAACCAA AAACTGAAGA 1260
[0041] CTCCACCCTT CTTAGAGTAT CAGAAAAGGA GGACTCAAAC CTCCATCTCC AGCTCCCAAA 1320
[0042] GCTGGTATTT TCAAATAAAC TACTCTCTGA AACCCTTAAA CCGCCCGAAT TGCCCCCCGA 1380
[0043] GACAACCCAC GCACAAGCTC TAGTACAACA AACAAAGCTA ACAACAAACC TCACCCAGCC 1440
[0044] ACCAAAAACA ACCCAACCCC ACATGAATAA AACACCGCAA CTCCACTAAA 1490
[0045] 。
[0046] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0047] 1、本發明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優點，能夠有效檢測出雞的 mtDNA Cytb基因全序列，從而為雞分子遺傳學及分子系統進化學研宄提供有效的研宄平 臺。與吳蟬等（黑龍江畜牧獸醫，2013年，第2期，第51?53頁）需要2對引物才能擴 增全長相比，更加簡便容易操作；
[0048] 2、本發明提供了一種節約成本、簡便易行的擴增雞mtDNA Cytb基因全序列的方 法，本發明提供的雞mtDNA Cytb基因全序列可應用于雞遺傳資源多樣性評估、母系起源、系 統進化分析和種質資源鑒定與保護等多個領域；
[0049] 3、本發明采用羽毛采集，替代傳統的血液采樣，減小了對實驗動物的傷害，并且能 獲得高質量的DNA模板。
【具體實施方式】
[0050] 一種雞mtDNA Cytb基因全序列的擴增及測序用引物，包括PCR引物和測序引物。
[0051] PCR 引物的上游引物為：5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，
[0052] PCR 引物的下游引物為：5' -TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'。
[0053] 測序引物為 Walking primer :5' -CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。
[0054] -種雞mtDNA Cytb基因全序列擴增及測序方法，包括以下步驟：
[0055] (1)提取雞羽毛中的DNA，并檢測質量；
[0056] (2)在雞mtDNA Cyt b基因上下游保守區域設計一對PCR引物，通過PCR 反應擴增包含Cytb基因的片段，經瓊脂糖凝膠電泳；所述PCR引物的上游引物為： 5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR 引物的下游引物為：5' -TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'，
[0057] (3)設計測序引物對PCR擴增產物進行測序，所述測序引物為Walking primer : 5'-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3' ；
[0058] (4)對測序獲得序列進行拼接，并減掉上下游多余的序列，獲得雞mtDNA Cyt b基 因全序列，雞mtDNA Cyt b基因全長為1143bp。
[0059] 所述用于擴增雞mtDNA Cyt b基因全序列的PC