發明提供培養基的配制
[0046]將900mL LONZA的X-VIVO 15培養基、100mL人血漿、1. OX 105U的IL-2、5 yg的 IL-21、5 y g的IL-15和5 y g的0KT-3混合，過濾除菌。
[0047] 實施例2本發明提供培養基的配制
[0048]將950mL L0NZA的X-VIV0 15培養基、50mL人血漿、4. OX 105U的IL-2、100 yg的 IL-21、100yg的IL-15和100yg的0KT-3混合，過濾除菌。
[0049] 實施例3本發明提供培養基的配制
[0050] 將 850mLL0NZA的X-VIV0 15 培養基、150mL人血漿、2.OX105U的IL-2、40yg的 IL-21、60yg的IL-15和40yg的0KT-3混合，過濾除菌。
[0051] 實施例4本發明提供培養基的配制
[0052]將 900mLL0NZA的X-VIV0 15 培養基、100mL人血漿、3.OX105U的IL-2、60yg的 IL-21、40yg的IL-15和60yg的0KT-3混合，過濾除菌。
[0053] 實施例5NK細胞的獲得
[0054] 1、采集外周血20ml，將外周血轉移到15mL離心管中，離心，將下層血細胞用生理 鹽水稀釋，混合均勻。
[0055] 2、另取一支新的50mL離心管，加入淋巴細胞分離液（血液稀釋液：淋巴分離液= 2:1)，將稀釋后的血液緩慢轉移至淋巴細胞分離液的表面，使二者之間形成清晰的界面。用 封口膜將離心管封口后轉移至離心機，離心30min;
[0056] 3、離心后用巴氏吸管將外周血單個核細胞（PBMC)層吸出，轉移至另一支50mL離 心管中。
[0057] 4、加生理鹽水洗滌PBMC兩次，每次離心5min。
[0058]5、棄上清，按照NK細胞分選試劑盒操作。
[0059]PBMC細胞和NK細胞的形態如圖1所示，圖1-a示PBMC形態（100倍）；圖1-b示 NK細胞形態（100倍）。
[0060] 圖2示分選前后細胞流失檢測結果；其中，圖2-a示分選前流式檢測的結果；圖 2_b示分選后流式檢測的結果。
[0061]經檢測，分選前NK細胞（CD3-CD56+)的比例為11. 2 %，分選后NK細胞（CD3-CD56+) 的比例為95. 4%。
[0062] 實施例6本發明提供方法擴增培養NK細胞
[0063] 取實施例5制備的NK細胞，以實施例1制備的培養基重懸，重懸后NK細胞的密度 為0. 5X106個/mL。置37°C、5%0)2飽和溫度培養箱中培養。每三天補充實施例1制備的 培養基，使NK細胞的密度為0. 5 X 106個/mL。連續培養14天，每天記錄細胞數量。
[0064] 實施例7本發明提供方法擴增培養NK細胞
[0065] 取實施例5制備的NK細胞，以實施例2制備的培養基重懸，重懸后NK細胞的密度 為1. 0X106個/mL。置37°C、5% 0)2飽和溫度培養箱中培養。每三天補充實施例2制備的 培養基，使NK細胞的密度為1.OX106個/mL。連續培養14天，每天記錄細胞數量。
[0066] 實施例8本發明提供方法擴增培養NK細胞
[0067] 取實施例5制備的NK細胞，以實施例3制備的培養基重懸，重懸后NK細胞的密度 為0. 5X106個/mL。置37°0、5%〇)2飽和溫度培養箱中培養。每三天補充實施例3制備的 培養基，使NK細胞的密度為1.OX106個/mL。連續培養14天，每天記錄細胞數量。
[0068] 實施例9本發明提供方法擴增培養NK細胞
[0069] 取實施例5制備的NK細胞，以實施例4制備的培養基重懸，重懸后NK細胞的密度 為1.0X106個/mL。置37°0、5%〇)2飽和溫度培養箱中培養。每三天補充實施例4制備的 培養基，使NK細胞的密度為0. 5X106個/mL。連續培養14天，每天記錄細胞數量。
[0070] 對比例1現有培養基擴增NK細胞
[0071] 1、培養基的配制：將950ml的1640培養基、50ml的胎牛血清、2.OX105U的IL-2、 20ug的IL-15混合，過濾除菌。
[0072] 2、取實施例5制備的NK細胞，以對比例1制備的培養基重懸，重懸后NK細胞的密 度為0. 5X106個/mL。置37°C、5% 0)2飽和溫度培養箱中培養。每三天補充對比例1制備 的培養基，使NK細胞的密度為0. 5X106個/mL。連續培養14天，每天記錄細胞數量。
[0073] 對比例2現有方法擴增NK細胞
[0074] 1、培養基的配制：將950ml的1640培養基、50ml人血漿、2.OX105U的IL-2、20ug 的IL-15混合，過濾除菌。
[0075] 2、取實施例5制備的NK細胞，每天記錄細胞數量。以對比例2制備的培養基重懸， 重懸后NK細胞的密度為2X106個/mL。置37°0、5%〇)2飽和溫度培養箱中培養。每三天 補充對比例2制備的培養基，使NK細胞的密度為2X106個/mL。連續培養14天，每天記錄 細胞數量。
[0076] 實施例10NK細胞擴增培養效率和純度檢測
[0077] 對實施例6?9及對比例1?2擴增NK細胞14天中，每天的計數結果進行統計， 結果如表1所示：
[0078] 表1 NK細胞擴增培養效果
[0079]
【主權項】
1. 一種擴增培養自然殺傷細胞的培養基，其特征在于，包括：無血清培養基、人血漿、 IL-2、IL-21、IL-15 和 0KT-3。
2. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述IL-2的濃度為100U/mL?400U/ mL〇
3. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述IL-21的濃度為5ng/mL?lOOng/ mL〇
4. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述IL-15的濃度為5ng/mL?lOOng/ mL〇
5. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述0KT-3的濃度為5年ng/mL? 100ng/mL〇
6. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述人血漿的體積分數為5?15%。
7. -種自然殺傷細胞的擴增培養方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :從人外周血中分離自然殺傷細胞； 步驟2 :以權利要求1?6任一項所述的培養基重懸所述自然殺傷細胞，37°C，C02體積 分數為5%，培養。
8. 根據權利要求7所述的擴增培養方法，其特征在于，所述培養為：每3天補充如權利 要求1?6任一項所述的培養基使自然殺傷細胞的密度為0. 5 X 106個/mL?1. 0X 10 6個 /mL〇
9. 根據權利要求7所述的擴增培養方法，其特征在于，所述重懸的自然殺傷細胞的密 度為 0. 5 X 106個 /mL ?1. 0 X 10 6個 /mL。
10. 根據權利要求7所述的擴增培養方法，其特征在于，所述自然殺傷細胞的純度不低 于 90%。
【專利摘要】本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種自然殺傷細胞的培養基及自然殺傷細胞的擴增培養方法。本發明提供了包含無血清培養基、人血漿、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3的擴增培養自然殺傷細胞的培養基。本發明提供的培養基用于擴增培養NK細胞，可以避免外源血清帶來的風險，擴增效率高且獲得NK細胞純度高。采用本發明提供的方法擴增NK細胞，能夠使NK細胞的擴增較長時間的維持在對數期。且培養獲得的NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性良好。
【IPC分類】C12N5-0783
【公開號】CN104593324
【申請號】CN201410705257
【發明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王一飛, 應杰, 王小燕, 羅二梅
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年11月28日