一種自然殺傷細胞的培養基及自然殺傷細胞的擴增培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種自然殺傷細胞的培養基及自然殺傷 細胞的擴增培養方法。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞（naturalkiller cell，NK)，又稱NK細胞，被認為是機體抗感染、 抗腫瘤的第一道天然防線，是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節 有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。NK細胞胞漿豐富，含有較 大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈正相關。NK細胞作用于靶細胞后殺傷 作用出現早，在體外1小時、體內4小時即可見到殺傷效應。NK細胞的靶細胞主要有某些腫 瘤細胞（包括部分細胞系）、病毒感染細胞、某些自身組織細胞（如血細胞）、寄生蟲等，因 此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第II型超敏反應和移植物抗宿主 反應。活化的NK細胞可合成和分泌多種細胞因子，發揮調節免疫和造血作用以及直接殺傷 靶細胞的作用。可見，NK細胞的培養具有十分重要的意義。
[0003] 目前大部分NK細胞培養體系采用胎牛血清加基礎培養基培養，但是采用胎牛血 清培養會存在異源血清所帶來的潛在危險。為此，也曾有報道用添加細胞因子IL-2或 IL-15的無血清培養基培養NK細胞以避免異源血清帶來的風險，但擴增NK的效果不明顯， 純度相對較低；無法達到臨床所需的細胞數量。
[0004] 因此，進一步研宄無異源血清的且能夠大量擴增NK，并獲得高純度NK的培養基和 培養方法十分必要。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種自然殺傷細胞的培養基及自然 殺傷細胞的擴增培養方法。以本發明提供的培養基及擴增培養方法培養自然殺傷細胞擴增 效率高，純度良好。
[0006] 本發明提供的擴增培養自然殺傷細胞的培養基，包括：無血清培養基、人血漿、 IL-2、IL-21、IL-15 和OKT-3。
[0007] 無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合 成培養基。無血清培養基的基本配方包括：胰島素、轉鐵蛋白、纖粘連蛋白。
[0008] 人血漿即人體血液中的液體成分，人的血細胞懸浮于其中。本發明采用人血漿，降 低異源性血清存在的潛在危險。
[0009] 11-2即白細胞介素-2(1拉61'16111^11-2，11-2)，又名1'細胞生長因子〇'〇611 growthfactor，TCRF)。可促進NK細胞的增殖，維持NK細胞長期生長。
[0010] IL-21即白細胞介素-21 (interleukin-21，IL-21)，參與調節T細胞的增殖。
[0011] 幾-15即白細胞介素-15(1拉61'16111^11-15，11-15)，生物學作用與11-2相似。
[0012] OKT-3為鼠源性抗人T淋巴細胞⑶3抗原單克隆抗體，目前未見OKT-3對NK細胞 活性或增殖特性影響的相關專利。
[0013] 在一些實施例中，IL-2的濃度為100U/mL?400U/mL。
[0014] 在另一些實施例中，IL-2的濃度為200U/mL?300U/mL。
[0015] 在一些實施例中，IL-21的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0016] 在另一些實施例中，IL-21的濃度為40ng/mL?60ng/mL。
[0017] 在一些實施例中，IL-15的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0018] 在另一些實施例中，IL-15的濃度為40ng/mL?60ng/mL。
[0019] 在一些實施例中，0KT-3的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0020] 在另一些實施例中，0KT-3的濃度為40g/mL?60g/mL。
[0021] 在一些實施例中，人血漿的體積分數為5?15%。
[0022] 在另一些實施例中，人血漿的體積分數為10%。
[0023] 在一些實施例中，無血清培養基采用LONZAX-VIV0 15。
[0024] LONZAX-VIV0 15由L0NZA公司生產，目前常用于培養人類單核細胞、巨噬細胞細 胞、粒細胞或自然殺傷（NK)細胞，但對NK細胞的培養時，NK細胞擴增效果不佳。
[0025] 本發明通過在無血清培養基中添加人血漿、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3,提高了 NK細胞的擴增效率和擴增后的NK細胞純度。與僅添加細胞因子IL-2和細胞因子IL-15的 對照組相比，本發明提供的培養基對NK細胞的擴增效率也有顯著的提高。
[0026] 本發明還提供了一種自然殺傷細胞的擴增培養方法，包括以下步驟：
[0027] 步驟1:從人外周血中分離自然殺傷細胞；
[0028] 步驟2 :以本發明提供的培養基重懸自然殺傷細胞，37°C，C02體積分數為5 %，培 養。
[0029] 在一些實施例中，培養為：每3天補充本發明提供的培養基使自然殺傷細胞的密 度為 0. 5X106個/mL?1. 0X10 6個 /mL。
[0030]作為優選，培養為：每3天補充本發明提供的培養基使自然殺傷細胞的密度為 0? 5X106個/mL〇
[0031] 每3天補充本發明提供培養基可以保證自然殺傷細胞在培養基中的量不至于過 高，從而避免NK細胞的增殖過早進入平穩期。采用本發明提供的方法，從第6天開始，NK細 胞增殖即進入對數期，在培養了 13天后NK細胞始終保持對數增長，在培養14天后，NK細胞 仍保持對數增長，且純度維持在95%以上。說明本發明提供的方法能夠有效提高NK細胞的 擴增效率，并能夠使NK細胞的擴增較長時間的維持在對數期，且使細胞保持較高的純度。
[0032] 在一些實施例中，重懸的自然殺傷細胞的密度為0. 5 X 106個/mL?1. 0 X 106個/ mL〇
[0033] 作為優選，重懸的自然殺傷細胞的密度為0. 5X 106個/mL。
[0034] 在一些實施例中，自然殺傷細胞的純度不低于90%。
[0035] 作為優選，自然殺傷細胞的純度為95%?96%。
[0036] 在本發明的實施例中，步驟1具體包括：以Ficoll淋巴分離液分離人血細胞獲得 外周血單個核細胞，經分選獲得自然殺傷細胞。
[0037] 本發明提供了包含無血清培養基、人血漿、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3的擴增培 養自然殺傷細胞的培養基。本發明提供的培養基用于擴增培養NK細胞，可以避免外源血清 帶來的風險，擴增效率高且獲得NK細胞純度高。采用本發明提供的方法擴增NK細胞，能夠 使NK細胞的擴增較長時間的維持在對數期。且培養獲得的NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性 良好。
【附圖說明】
[0038] 圖1示PBMC細胞和NK細胞的形態；其中，圖1-a示PBMC形態（100倍）；圖1-b 示NK細胞形態（100倍）；
[0039] 圖2示分選前后細胞流式檢測結果；其中，圖2-a示分選前流式檢測的結果；圖 2_b示分選后流式檢測的結果；
[0040] 圖3示實施例6培養14天后的NK細胞的流式檢測結果；
[0041] 圖4示實施例6獲得的NK細胞對K562細胞的殺傷活性。
【具體實施方式】
[0042] 本發明提供了一種自然殺傷細胞的培養基及自然殺傷細胞的擴增培養方法，本領 域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方 法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和 范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0043] 本發明采用的試劑和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0044] 下面結合實施例，進一步闡述本發明：
[0045] 實施例1本