波長下未檢測到熒光，表示寡聚體序列4未通過手臂分子6固定在基片7上，判定為基因芯片質(zhì)量不合格。
[0025]4、將待測序列雜交
將第二熒光基團(tuán)標(biāo)記的待測序列5與質(zhì)量合格基因芯片上所述的探針斑點中的目的探針3在高溫T2下進(jìn)行雜交，高溫T 2范圍為20~60° C，雜交后，目的探針3中的探針和待測序列5結(jié)合形成第二雜交產(chǎn)物；
5、確定待測序列5的序列信息
對所述第二雜交產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，若在第二熒光基團(tuán)I的激發(fā)波長下檢測到熒光，則確定目的探針3與待測序列5互補，并確定待測序列5的序列信息；
若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下未檢測到熒光，則表示不能確定目的探針3與待測序列5互補，無法確定待測序列5的序列信息。
[0026]本發(fā)明通過在目的探針與第一熒光基團(tuán)I標(biāo)記的寡聚體序列先雜交，優(yōu)勢是可以為目的探針與待測序列的提供空間位置，方便待測序列與目的探針結(jié)合，并由多個待測序列分別與相對應(yīng)的目的探針結(jié)合在同一修飾基片中構(gòu)成一種可以用于控制質(zhì)量的基因芯片。
[0027]通過在第一熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下檢查探針是否固定于基片上，再在熒光基團(tuán)I的激發(fā)波長下檢測待測片段DNA序列。若在第二熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下沒有檢測到熒光則表示探針未固定，若這時能檢測到熒光而在第一熒光基團(tuán)的激發(fā)波長下沒有檢測到熒光則表明結(jié)果為陰性，若兩次都檢測到熒光則結(jié)果為陽性。不同的是，由于目的探針與標(biāo)記第一熒光基團(tuán)的寡聚體序列穩(wěn)定雜交的溫度0~30 ° C較低，而與樣品穩(wěn)定雜交的溫度20~60° C較高。也就是說，較低溫度0~30 ° C下，標(biāo)記第一熒光基團(tuán)的寡聚體序列與目的探針可以穩(wěn)定雜交(如圖2a)，而在較高溫度20~60 ° C下，目的探針與待測序列可以穩(wěn)定雜交(如圖2b)。因此在目的探針與樣品進(jìn)行雜交之前就應(yīng)當(dāng)檢測第二熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。
[0028]實施例1:轉(zhuǎn)基因大?檢測基因芯片
1、樣品制備: 制備轉(zhuǎn)基因大豆的目的探針 5’-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAC GGG AAA CGACAA TCT G-3’的溶液，和采用第一熒光基團(tuán)Cy5標(biāo)記寡聚體序列5’-Cy5-TTT TTT TTT TTTTTT-3’的溶液，將上述兩個點樣溶液充分混合，制備成點樣溶液。
[0029]2、基因芯片制備:
上述混合后的點樣溶液點樣于醛基片上，醛基片是經(jīng)硅烷、戊二醛處理的玻璃片制備成末端修飾了醛基的基片，在醛基片上形成N個探針斑點，N為自然數(shù)，經(jīng)固定，在低溫25° C下，所述所有探針斑點中目的探針5’-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGAAAC GAC AAT CTG-3’ 與 Cy5 標(biāo)記寡聚體序列 5’-Cy5_TTT TTT TTT TTT TTT-3’ 發(fā)生雜交反應(yīng)，獲得每個探針斑點對應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液；清除未固定的探針3和未雜交的寡聚體序列4,完成基因芯片的制備。
[0030]3、通過檢測寡聚體序列5’-Cy5_TTT TTT TTT TTT TTT-3’的溶液的信號檢測轉(zhuǎn)基因大豆的目的探針5’-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3’通過醛基固定在玻璃片上檢測上述所有第一雜交產(chǎn)物溶液發(fā)出的熒光信號，若在Cy5的激發(fā)波長633 nm下檢測到熒光，則表示寡聚體序列5’-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3’的溶液通過醛基固定在玻璃片上，同時說明轉(zhuǎn)基因大豆的目的探針5’ -NH2-MA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AACGAC AAT CTG-3’能通過醛基固定在玻璃片上，從而判定基因芯片質(zhì)量合格。
[0031]否則，若任一個探針斑點對應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液在Cy5的激發(fā)波長633 nm下未檢測到熒光，表示寡聚體序列5’-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3’的溶液未能通過醛基固定在玻璃片上，判定為基因芯片質(zhì)量不合格。
[0032]4、將待測DNA序列雜交:
將上游引物 5’-CTG CTC CAC TCT TCC TTT-3’、下游引物 5’-AGA CTC TGT ACC CTGACC T-3’，及轉(zhuǎn)基因大豆基因組、Tak酶作用下，經(jīng)PCR擴增得到第二熒光基團(tuán)Cy3標(biāo)記的待測序列5，將其與質(zhì)量合格基因芯片上所述的探針斑點中的目的探針5’-NH2-AAA AAA AMAAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3’ 在 55。C 進(jìn)行雜交，雜交后，目的探針5’-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3’ 中的探針和待測序列5結(jié)合形成第二雜交產(chǎn)物。
[0033]5、確定待測序列5的序列信息:
對所述第二雜交產(chǎn)物溶液進(jìn)行熒光信號檢測，若在Cy3的激發(fā)波長533 nm下檢測到熒光，則確定轉(zhuǎn)基因大豆的目的探針5’-NH2-AM AM MA MA MA CTG AAG GCG GGA MC GACAAT CTG-3’與待測序列互補，并確定待測序列5的序列信息含有序列5’-CAG ATT GTC CTTACC CGC GTT CAG-3，。
[0034]若在Cy3的激發(fā)波長533 nm下未檢測到熒光，則表示不能確定轉(zhuǎn)基因大豆的目的探針 5’ -NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3’ 與待測序列 5互補，從而無法確定待測序列的排布信息。
【主權(quán)項】
1.一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，該方法包括以下幾個步驟: 步驟一:樣品制備: 制備含有目的探針(3)的溶液和第一熒光基團(tuán)(I)標(biāo)記的寡聚體序列(4)的溶液；并將上述目的探針(3)的溶液和第一熒光基團(tuán)標(biāo)記(I)標(biāo)記的寡聚體序列(4)的溶液充分混合，制備成點樣溶液； 步驟二:基因芯片制備 將上述混合后的點樣溶液點樣于修飾于手臂分子(6)的基片(7)上形成N個探針斑點，N為自然數(shù)，經(jīng)固定，在低溫1\下，低溫T1范圍為0~30 ° C，所述所有探針斑點中目的探針(3)與第一熒光基團(tuán)(I)標(biāo)記的寡聚體序列(4)發(fā)生雜交反應(yīng)，獲得每個探針斑點對應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液；清除未固定的探針和未雜交的寡聚體序列，完成基因芯片的制備； 步驟三:通過檢測寡聚體序列(4 )的信號檢測目的探針(3 )通過手臂分子(6 )固定在基片(7)上: 檢測上述所有第一雜交產(chǎn)物溶液發(fā)出的熒光信號，若在第一熒光基團(tuán)(I)的激發(fā)波長下檢測到熒光，則表示寡聚體序列(4)通過手臂分子(6)固定在基片(7)上，同時說明目的探針(3 )通過手臂分子(6 )固定在基片(7 )上； 否則，若任一個探針斑點對應(yīng)的第一雜交產(chǎn)物溶液在第一熒光基團(tuán)(I)的激發(fā)波長下未檢測到熒光，表示寡聚體序列(4 )未通過手臂分子(6 )固定在基片(7 )上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，還包括以下步驟: 步驟四:將待測序列(5)雜交 將第二熒光基團(tuán)(2)標(biāo)記的待測序列(5)與質(zhì)量合格基因芯片上所述的探針斑點中的目的探針(3)在高溫T2下進(jìn)行雜交，高溫T 2范圍為20~60° C，雜交后，目的探針(3)中的探針和待測序列(5)結(jié)合形成第二雜交產(chǎn)物； 步驟五:確定待測序列(5)的序列信息 對所述第二雜交產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，若在第二熒光基團(tuán)(2)的激發(fā)波長下檢測到熒光，則確定目的探針(3)與待測序列(5)互補，并確定待測序列(5)的序列信息； 若在第二熒光基團(tuán)(2)的激發(fā)波長下未檢測到熒光，則表示不能確定目的探針(3)與待測序列(5)互補，無法確定待測序列(5)的序列信息。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的低溫和高溫相差不小于10° C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的目的探針(3)是脫氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的基片(7)為玻璃片、硅膠晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微型磁珠或者管至JHL ο
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的第一熒光基團(tuán)(I)和所述的第二熒光基團(tuán)(2)不相同，且上述兩種熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射峰大于40nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的第一熒光基團(tuán)(I)和所述的第二熒光基團(tuán)(2)為Cy3、Cy5、Fite、FAM或者Rhodamine。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于，所述的第一熒光基團(tuán)(I)和第二熒光基團(tuán)(2)為生物素-親和素與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，其特征在于所述的標(biāo)記物質(zhì)為熒光蛋白、鐵蛋白、膠體金、熒光素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，利用兩種不同熒光標(biāo)記對基因芯片進(jìn)行質(zhì)量控制，在較低溫下，目的探針與帶第一熒光基團(tuán)標(biāo)記寡聚體序列先進(jìn)行雜交，檢測第一熒光基團(tuán)，判斷目的探針是否固定于基片上；在較高溫下，目的探針與第二熒光基團(tuán)標(biāo)記待檢測的DNA序列雜交，檢測第二熒光基團(tuán)，判斷檢測的DNA序列信息。同時使用兩種熒光能快速、簡便地檢測目的探針是否固定在基片上，從而排除因目的探針未固定而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果，提高基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561292
【申請?zhí)枴緾N201410833494
【發(fā)明人】劉全俊, 侯傳榮, 于靜靜, 余筠如, 包鎮(zhèn), 汪榮亮, 谷德健
【申請人】東南大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月30日