一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法
【專利說明】
[0001]技術領域:
本發明屬于基因芯片質量控制領域，具體涉及一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法。
[0002]【背景技術】:
基因芯片技術作為近年來快速發展的一項生物高新技術，為解決怎樣研究基因在生命過程中所擔負的功能提供了光輝的前景。基因芯片技術是指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。
[0003]與傳統核酸印跡雜交方法相比，基因芯片同時將大量根據靶基因的特征及檢測要求預先設計好的探針固定在支持物表面，一次雜交可檢測和分析樣品中多種靶基因的相關信息，解決了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足，使基因芯片技術具有了高通量、多參數同步分析，快速全自動分析，高精確度分析，高靈敏度分析的特點。但用熒光標記的PCR產物與匹配探針雜交對未知DNA序列片段進行檢測的方法本身也存在缺陷:
I)基因芯片熒光檢測主要依賴于檢測結果的熒光強度，沒有熒光強度或者熒光強度弱的即判斷為陰性，但在陰性的結果中無法確定是否是探針固定上；2)多種基因芯片技術平臺得到的研究結果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成為目前基因技術研究的熱點，尤其是應用型基因芯片尚無一些準確、高效地有效性檢測方法，其應用的推廣尚有困難。因此發展一種準確、高效地有效性檢測方案來檢測探針是否固定成為一種迫切的需要。
[0004]基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探針、支持物制備的有效性控制、探針在支持物上的固定效率即基因芯片制備的有效性控制，以及基因芯片檢測時的有效性控制、檢測結果的標準化等一系列問題。本專利主要針對的是制備有效性的基因芯片。
[0005]制備有效性基因芯片的傳統方法有以下幾種:一種方法是利用熒光DNA染料對單鏈DNA探針染色，根據熒光DNA染料強度來估計芯片的有效性；利用目的探針3點樣液和熒光基團I標記的質量控制探針8點樣液分別點樣于修飾了手臂分子6的基質7上，形成各自的斑點，然后使目的探針3在斑點處與帶基團有同種或異種熒光基團標記2的待測DNA序列雜交，根據質量探針8點樣位置是否發熒光，估計芯片的有效性，根據目的探針點位置是否發熒光，判定待測DNA序列信息，如圖1所示。但是以上的這些方法都無法直接、有效地評價芯片制備的質量。
[0006]這種基因芯片質量控制的方法可減少了基因檢測中假陽性結果出現的可能性，極大地提高了檢測結果的準確性。通常基因芯片的缺陷是其自身質量無法得到較好的控制，如果能夠有一種方法能夠對這樣一種新型的基因芯片對芯片的有效性進行控制，那么將會大大提高其檢測的可靠性，為其利用的推廣更進一步。
[0007]
【發明內容】
:
針對現有技術的不足，本發明提供了一種基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，能較直接地檢測探針是否固定在基片上，以排除因探針缺失而造成的陰性結果出現的可能性，提聞了基因芯片檢測的準確性和可罪性。
[0008]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
本發明基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法包括以下幾個步驟:
步驟一:樣品制備:
制備含有目的探針的溶液和第一熒光基團標記的寡聚體序列的溶液；并將上述目的探針的溶液和第一熒光基團標記的寡聚體序列的溶液充分混合，制備成點樣溶液；
步驟二:基因芯片制備
將上述混合后的點樣溶液點樣于修飾了手臂分子的基片上形成N個探針斑點，N為自然數，經固定，在低溫!\下，低溫T1范圍為0~30 ° C，所述所有探針斑點中目的探針與第一熒光基團標記的寡聚體序列發生雜交反應，獲得每個探針斑點對應的第一雜交產物溶液；清除未固定的探針和未雜交的寡聚體序列，完成基因芯片的制備；
步驟三:通過檢測寡聚體序列(4)的信號檢測目的探針通過手臂分子固定在基片上:檢測上述所有第一雜交產物溶液發出的熒光信號，若在第一熒光基團的激發波長下檢測到熒光，則表示寡聚體序列通過手臂分子固定在基片上，同時說明目的探針通過手臂分子固定在基片上，從而判定基因芯片質量合格；
否則，若任一個斑點中在第一突光基團的激發波長下未檢測到突光，表不寡聚體序列未通過手臂分子固定在基片上，判定為基因芯片質量不合格。
[0009]本發明混合型探針檢測基因芯片有效性的方法，還包括以下步驟:
步驟四:雜交
將第二熒光基團標記的待測序列與質量合格的基因芯片上點樣的斑點中的目的探針在高溫T2下進行雜交，高溫T2范圍為20~60° C，雜交后，目的探針中的探針和待測序列結合形成第二雜交產物；
步驟五:確定待測序列的序列信息
對所述第二雜交產物進行熒光信號檢測，若在第二熒光基團的激發波長下檢測到熒光，則確定目的探針與待測序列互補，并確定待測序列的序列信息；
若在第二熒光基團的激發波長下未檢測到熒光，則表示不能確定目的探針與待測序列互補，無法確定待測序列的序列信息。
[0010]所述的低溫和高溫相差不小于10° C。
[0011]所述的目的探針是脫氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
[0012]所述的基片為玻璃片、硅膠晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、微型磁珠或者管蓋。
[0013]所述的第一熒光基團和所述的第二熒光基團可為Cy3、Cy5、Fite, FAM或者Rhodamine，但是所述的第一熒光基團和所述的第二熒光基團使用時不相同，并且在檢測時兩種熒光基團的熒光發射峰要大于40nm的差異，防止兩者在檢測時由于吸收峰重疊而無法正確得出結果。
[0014]所述的第一熒光基團和第二熒光基團為生物素-親和素與標記物質結合的標記復合物。
[0015]所述的標記物質為熒光蛋白、鐵蛋白、膠體金、熒光素或化學發光物質。
[0016]本專利所提的目的探針是一段已知的核酸或核酸類似物序列片斷，并在核酸或核酸類似物鏈上修飾了活性基團，可通過化學反應固定在被修飾手臂分子的基底上；寡聚體序列是一段已知的、較短核酸或核酸類似物序列片斷，末端標記了發光基團或標記復合物；待測序列是一段未知的核酸或核酸類似物序列片斷，末端標記了發光基團或標記復合物；手臂分子是多個碳原子組成兩端均含有活性基團的小分子有機化合物，一端活性基團可與基底發生化學反應，另一端活性基團可與修飾了活性基團的核酸或核酸類似物鏈發生化學反應。
[0017]與現有技術相比，本發明具有的有益效果是:
I)傳統的檢測，只是把一定濃度的質量控制探針固定在目的探針的周圍，質量控制探針與目的探針分開點樣于基片上，沒有考慮到目的探針與待測DNA序列的雜交通常位于固相表面，有一定程度的空間阻礙，若目的探針濃度過高，導致目的探針固定不上去，而本發明是先將目的探針與第一熒光基團標記的寡聚體序列雜交，為后續目的探針與待測DNA序列的提供雜交空間位置，這樣大大方便了待檢測的DNA序列與目的探針雜交。
[0018]2)目的探針與標記第一熒光的寡聚體序列混合，點樣，雜交，因目的探針和寡聚體序列互補，存在分子之間的力，通過檢測第一種熒光，可確定目的探針是否通過手臂分子結合在基片上，保證了芯片制作的質量，這種方式也達到實時監測實時監測整個芯片的有效性。
[0019]3)因寡聚體序列相對于目的探針較短，低溫0~30 ° C時，目的探針與與標記第一熒光的寡聚體序列雜交，高溫20~60 ° C時，目的探針與標記第二熒光基團的待測序列雜交，通過雜交溫度的控制達到與目的探針雜交與寡聚體序列還是待測序列的類型，設計精巧，操作簡便。
[0020]4)本發明檢測基因芯片有效性的方法，若應用于基因芯片制備中，則能夠大大提高基因檢測結果的準確性及可靠性；同時，不僅可以為基因芯片的制造者提供有效性控制的方法，提高生產質量，又可以為基因芯片的使用者在使用之前對芯片做出評價，簡單有效地查出實驗中可能出現的問題，從而減少了實驗中的分析過程，提高了實驗效率。
【附圖說明】
[0021]圖1為現有技術中的基因芯片有效性的方法的結構示意圖；
圖2 Ca)為本發明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法低溫下的結構示意圖；
圖2 (b)為本發明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法高溫下的結構示意圖；
圖3 (a)為本發明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法低溫下結構局部放大示意圖；
圖3 (b)為本發明的基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法高溫下結構局部放大示意圖。
[0022]圖中:1、第一熒光基團，2、第二熒光基團，3、目的探針，4、寡聚體序列，5、待測序列，6、手臂分子，7、基片，8、質量控制探針。
【具體實施方式】
[0023]下面將結合附圖對本發明作進一步說明。
[0024]本發明基于溫度差異性探針基因芯片檢測方法，包括以下幾個步驟: 1、樣品制備:
如圖2 a、2b、3a、3b所示，制備含有目的探針3的溶液和第一熒光基團I標記的寡聚體序列4的溶液；并將上述目的探針3的溶液和第一熒光基團標記I標記的寡聚體序列4的溶液充分混合，制備成點樣溶液；
2、基因芯片制備
將上述混合后的點樣溶液點樣于修飾了手臂分子6的基片7上形成N個探針斑點，N為自然數，經固定，在低溫1\下，低溫T1范圍為0~30 ° C，所述所有探針斑點中目的探針3與第一熒光基團I標記的寡聚體序列4發生雜交反應，獲得每個探針斑點對應的第一雜交產物溶液；清除未固定的探針3和未雜交的寡聚體序列4，完成基因芯片的制備；
3、通過檢測寡聚體序列4的信號檢測目的探針3通過手臂分子6固定在基片7上: 檢測上述所有第一雜交產物溶液發出的熒光信號，若在第一熒光基團I的激發波長下檢測到熒光，則表示寡聚體序列4通過手臂分子6固定在基片7上，同時說明目的探針3通過手臂分子6固定在基片7上，從而判定基因芯片質量合格；
否則，若任一個探針斑點對應的第一雜交產物溶液在第一熒光基團I的激發