1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中的培養(yǎng)方法,其特征在于,包括:將分選得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),氧氣濃度控制在4-5%;培養(yǎng)溫度為37±0.5℃,培養(yǎng)液采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子fgf、表皮生長(zhǎng)因子egf、b27補(bǔ)充劑、l-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物;基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi?1640培養(yǎng)基;培養(yǎng)時(shí)間為3-10天,培養(yǎng)期間持續(xù)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,一旦細(xì)胞出現(xiàn)衰老,立即將細(xì)胞挑取出來(lái)進(jìn)行建庫(kù)操作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法,其特征在于,抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物為青霉素/鏈霉素或兩性霉素b。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法,其特征在于,所述培養(yǎng)液的制備方法為:向每500ml的rpmi?1640培養(yǎng)基中加入4-6ml的l-谷氨酰胺、9-12ml的b27補(bǔ)充劑、2.5-3μg的fgf,2.5-3μg的egf,10ml-12ml的雙抗組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法,其特征在于,判斷細(xì)胞衰老的方法為:出現(xiàn)細(xì)胞核顏色加深或細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變形,即表示細(xì)胞開始衰老。
5.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的建庫(kù)方法,其特征在于,包括:從血液中分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞,體外培養(yǎng)、單細(xì)胞挑選、建庫(kù)和測(cè)序;所述體外培養(yǎng)采用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的建庫(kù)方法,其特征在于,采用細(xì)胞淘析機(jī)從血液中分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的建庫(kù)方法,其特征在于,所述單細(xì)胞挑選是對(duì)經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞,采用玻璃針管進(jìn)行手動(dòng)挑取;具體操作為:以酒精消毒過(guò)的毛細(xì)管為原材料,加熱變軟后拉制得到管中心為0.2mm±0.05mm的玻璃針管;提前將液氮到入保溫杯,在10×鏡下從培養(yǎng)液中挑選直徑約20μm±2μm的細(xì)胞,將玻璃針管插入口吸管的接頭處,利用口吸管提供負(fù)壓,吸取細(xì)胞及1-2μl培養(yǎng)液,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃針管內(nèi)后將細(xì)胞吹到含有3μl的裂解液的離心管中,離心管放入裝液氮的保溫杯,保存于-80℃冰箱。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的建庫(kù)方法,其特征在于,所述建庫(kù)和測(cè)序的過(guò)程包括如下步驟: