一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中的培養(yǎng)方法和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的建庫(kù)方法

本發(fā)明涉及細(xì)胞組織庫(kù)構(gòu)建的，具體涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中的培養(yǎng)方法和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的建庫(kù)方法。

背景技術(shù)：

1、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating?tumor?cells，簡(jiǎn)稱ctcs)是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶中脫落并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞有可能通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)身體其他部位，并在那里形成新的腫瘤，即轉(zhuǎn)移灶。ctcs的數(shù)量極少，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中含量極少，約每10毫升血液含有1-10個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，甚至在每107個(gè)血液細(xì)胞中僅含有1個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。ctcs的重要性在于它們與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。能夠成功進(jìn)入血液循環(huán)并存活下來(lái)的ctcs往往具有高度的活力和轉(zhuǎn)移潛能。由于這些特性，ctcs成為了研究腫瘤生物學(xué)和開(kāi)發(fā)新型診斷工具的重點(diǎn)對(duì)象之一。ctcs的捕獲和分析有助于理解腫瘤的異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及耐藥性的發(fā)展，為開(kāi)發(fā)新型治療方法提供信息。由于ctcs的數(shù)量非常稀少，通常每毫升血液中只有幾個(gè)至幾十個(gè)，因此其檢測(cè)是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)，但同時(shí)也為臨床提供了寶貴的液體活檢(liquid?biopsy)手段，即無(wú)需侵入性地獲取組織樣本即可獲得有關(guān)腫瘤的信息。通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)，進(jìn)行基因表達(dá)分析或者基因組變異分析，可揭示細(xì)胞的異質(zhì)性和復(fù)雜性。

2、然而，目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大批量全長(zhǎng)建庫(kù)并測(cè)序目前還處于較為不成熟的階段，可以被捕獲并且成功建庫(kù)測(cè)序的循環(huán)腫瘤細(xì)胞比較少，同時(shí)也存在如下問(wèn)題：(1)目前，研究人員一般通過(guò)微流控裝置對(duì)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行陰性或者陽(yáng)性篩選，篩選后利用流式細(xì)胞儀等設(shè)備將細(xì)胞分選并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性篩選一般是選用epcam陽(yáng)性對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分選，但是大量文獻(xiàn)研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性較大，部分循環(huán)腫瘤細(xì)胞并沒(méi)有epcam陽(yáng)性，這導(dǎo)致在分選過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的丟失，準(zhǔn)確率低，無(wú)法解決epcam陽(yáng)性識(shí)別逃逸問(wèn)題。陰性篩選則會(huì)導(dǎo)致有較多白細(xì)胞等其他細(xì)胞參與干擾，篩選難度大，后續(xù)如何高效快速的將分選出的細(xì)胞分開(kāi)并進(jìn)行培養(yǎng)和建庫(kù)仍然是難點(diǎn)。(2)目前大多數(shù)研究是在循環(huán)腫瘤細(xì)胞剛剛從血液中被分選出來(lái)后立即進(jìn)行監(jiān)測(cè)和建庫(kù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)循環(huán)腫瘤細(xì)胞在分選過(guò)程中遭受重創(chuàng)甚至導(dǎo)致其rna降解，此時(shí)測(cè)序無(wú)法反應(yīng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員往往并未意識(shí)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)序時(shí)機(jī)對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響，而即便意識(shí)到該問(wèn)題也因分選出來(lái)的ctcs的狀態(tài)極差和難以存活而不得不在獲得ctcs后立即進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)、不足，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中的培養(yǎng)方法和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的建庫(kù)方法；一方面，本發(fā)明提供了一種ctcs的培養(yǎng)方法，可在體外對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使分選出來(lái)的ctcs能夠在進(jìn)行一段時(shí)間的狀態(tài)恢復(fù)甚至增殖后再進(jìn)行檢測(cè)，使檢測(cè)結(jié)果更能反應(yīng)ctcs的真實(shí)狀態(tài)并獲取更多的檢測(cè)樣本；另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了ctcs的分選及擴(kuò)增后的樣本純化和片段化處理等過(guò)程，節(jié)省細(xì)胞挑選成本和提高分選精準(zhǔn)度和成功率，提高樣本純度，使樣本片段化更加均勻，提升后續(xù)測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

3、(二)技術(shù)方案

4、第一方面，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中的培養(yǎng)方法，其包括：將分選得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，氧氣濃度控制在4-5％；培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，培養(yǎng)液采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子fgf、表皮生長(zhǎng)因子egf、b27補(bǔ)充劑、l-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi?1640培養(yǎng)基；培養(yǎng)時(shí)間為3-10天，培養(yǎng)期間持續(xù)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，一旦細(xì)胞出現(xiàn)衰老，立即將細(xì)胞挑取出來(lái)進(jìn)行建庫(kù)操作。

5、根據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例，抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物為青霉素/鏈霉素或兩性霉素b。

6、根據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例，所述培養(yǎng)液的制備方法為：向每500ml的rpmi?1640培養(yǎng)基中加入4-6ml的l-谷氨酰胺、9-12ml的b27補(bǔ)充劑、2.5-3μg的fgf，2.5-3μg的egf，10ml-12ml的雙抗組合物。

7、根據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例，判斷細(xì)胞衰老的方法為：出現(xiàn)細(xì)胞核顏色加深或細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變形，即表示細(xì)胞開(kāi)始衰老。此時(shí)將細(xì)胞挑取出來(lái)，保證細(xì)胞處于生長(zhǎng)較好狀態(tài)，有較多rna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的建庫(kù)方法，其包括：從血液中分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)、單細(xì)胞挑選、建庫(kù)和測(cè)序；所述體外培養(yǎng)采用上述任一實(shí)施例中所記載的培養(yǎng)方法。經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使從血液中分選出來(lái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞得以狀態(tài)恢復(fù)和細(xì)胞增殖，一方面減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞rna的降解情況，另一方面可能會(huì)使循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增多，便于獲得更多細(xì)胞樣本。

9、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，采用細(xì)胞淘析機(jī)從血液中分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

10、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，所述單細(xì)胞挑選是對(duì)經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，采用玻璃針管進(jìn)行手動(dòng)挑??；具體操作為：以酒精消毒過(guò)的毛細(xì)管為原材料，加熱變軟后拉制得到管中心為0.2mm±0.05mm的玻璃針管；提前將液氮到入保溫杯，在10×鏡下從培養(yǎng)液中挑選直徑約20μm±2μm的細(xì)胞，將玻璃針管插入口吸管的接頭處，利用口吸管提供負(fù)壓，吸取細(xì)胞及1-2μl培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃針管內(nèi)后將細(xì)胞吹到含有3μl裂解液的離心管中，離心管放入裝液氮的保溫杯，保存于-80℃冰箱。

11、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，所述建庫(kù)和測(cè)序的過(guò)程包括如下步驟：

12、(1)裂解和反轉(zhuǎn)錄：將盛裝細(xì)胞和裂解液的離心管置于加熱條件下裂解，得到細(xì)胞裂解液，配制反轉(zhuǎn)錄液，將反轉(zhuǎn)錄液與細(xì)胞裂解液混合，在熱循環(huán)儀中孵化；

13、裂解液中加入寡核苷酸smartseq3_oli?godt30vn的序列為/5biosg/acgagcatcagcagcatacgatttttttttttttttttttttt?t?tttttttvn；反轉(zhuǎn)錄液中加入寡核苷酸smartseq3_n?8_tso的序列為/5biosg/agagacagattgcgcaat?gnnnnnnnnrgrgrg；

14、(2)預(yù)擴(kuò)增：

15、配制預(yù)擴(kuò)增體系，將預(yù)擴(kuò)增體系加到步驟(1)處理的離心管中，混勻后將離心管放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；正向擴(kuò)增引物fwd為tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagattgcgcaa*t*g；反向擴(kuò)增引物rev為acgagcatcagcagcatac*g*a；

16、(3)純化：預(yù)擴(kuò)增結(jié)束后，向預(yù)擴(kuò)增樣本的離心管中加入超純水稀釋,再加入dna純化磁珠，dna純化磁珠的加入體積與加入前離心管內(nèi)液體的體積比為35:50，用超純水洗脫cdna；

17、(4)cdna質(zhì)量檢查：利用qubit?dsdna?hs檢測(cè)試劑盒檢測(cè)cdna文庫(kù)質(zhì)量，使用標(biāo)準(zhǔn)卡夾測(cè)量dna片段大小，保留片段大小900-1100kb的片段；

18、(5)cdna片段化：按照每1ng的cdna加入1μl?amplicon?tagmentation?mix(tn5)的比例得到片段化混合液，放置到恒溫金屬浴中55℃處理5min；然后室溫下加入0.2％的sds，放置恒溫金屬浴中55℃處理5min；

19、(6)純化：向步驟(5)的混合液中，按樣本總體積62.5：50的體積比例加入dna純化磁珠進(jìn)行純化處理，隨后用超純水洗脫dna；

20、(7)樣本擴(kuò)增：使用步驟(6)獲得的dna與nextera?index引物配制樣本擴(kuò)增體系，在熱循環(huán)儀中孵育樣本；

21、(8)純化：按0.8：1的體積比例加入dna純化磁珠，最后用超純水洗脫樣本，利用qubit?dsdna?hs檢測(cè)試劑盒檢測(cè)cdna文庫(kù)質(zhì)量，用標(biāo)準(zhǔn)卡夾(c105101)測(cè)量cdna片段大小，保留分布300-500kb的片段；

22、(9)在illumina兼容的測(cè)序儀上測(cè)序并整理數(shù)據(jù)。

23、(三)有益效果

24、(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了適合循環(huán)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液，使分選出來(lái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞先短暫培養(yǎng)一段時(shí)間，使循環(huán)腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)得到恢復(fù)，減少rna的降解程度，恢復(fù)細(xì)胞活力，之后再進(jìn)行裂解、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序等處理，有利于獲得更準(zhǔn)確的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)；對(duì)于一些惡性程度較高的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后還能使細(xì)胞數(shù)量增加，增加可用的樣本數(shù)量。

25、(2)本發(fā)明采用細(xì)胞淘析機(jī)分選和培養(yǎng)后采用玻璃針管進(jìn)行手動(dòng)挑取，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的甄別主要依賴于人力手動(dòng)挑取獲得，相比現(xiàn)有技術(shù)采用epcam陽(yáng)性分選的技術(shù)，不僅成本低且準(zhǔn)確率高、不易出現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的丟失等問(wèn)題，也不會(huì)出現(xiàn)陰性篩選導(dǎo)致的有大量白細(xì)胞等干擾的問(wèn)題。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量極少，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)上循環(huán)腫瘤細(xì)胞也是10ml有7個(gè)左右，因此手動(dòng)挑取并不會(huì)增加過(guò)多勞動(dòng)成本，相較于現(xiàn)有技術(shù)可顯著降低成本并提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞獲取的成功率。

26、(3)相較于現(xiàn)有的smartseq3實(shí)驗(yàn)方案，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了樣本純化的操作和條件，優(yōu)化dna片段化的混合液體系，提高最終獲得的dna純度，使dna片段更均勻，提升了后續(xù)測(cè)序的效率和數(shù)據(jù)質(zhì)量。