轉基因工程番茄果實中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法與流程

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種轉基因工程番茄果實中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，同時還提供轉基因工程番茄果實中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法。

背景技術：
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蝦青素是自然界中抗氧化活性最強的生物活性物質，隨著植物基因工程技術的發展，以植物尤其是經濟作物作為生物反應器生產蝦青素已成為國內外研究的熱點，蝦青素是分子結構獨特的酮式類胡蘿卜素，是自然界中抗氧化活性最強的生物活性物質，具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤和預防心血管等疾病的功效，已應用于化妝品、保健品和水產養殖等方面。商業化的天然蝦青素主要來源于雨生紅球藻，該藻為光合自養綠藻，對環境敏感、生長慢、難以實現高密度的細胞生長，這是目前國內外無法突破其產量瓶頸以及蝦青素價格昂貴的主要原因。植物因缺乏類胡蘿卜素酮化酶(bkt)而不合成蝦青素，表達外源的bkt可能使植物尤其是經濟作物成為高效的蝦青素生產工廠。黃俊潮等通過基因工程技術將綠藻中篩選和分離到能催化植物細胞中β-胡蘿卜素和玉米黃素成蝦青素的酮化酶和羥化酶基因轉入野生型番茄植株中，首次獲得了一種富含蝦青素的轉基因工程番茄，其成熟果實中蝦青素的含量高達16.1mg/g,克服了植物難以積累高含量蝦青素的難題，以此種轉基因工程番茄作為生物反應器生產蝦青素具有極大的商業前景。

蝦青素對光、溫比較敏感，在提取加工過程中,光、熱、氧等很多因素可促進或加速蝦青素發生降解；且傳統的有機溶劑提取法因殘留物無法完全去除，而對人體造成傷害，破壞機體免疫系統,引起癌癥等疾病的發生。超臨界二氧化碳流體萃取是一種新型的萃取技術，具有萃取和分離的雙重作用，萃取過程物料無相變因而節能明顯，且工藝流程簡單，萃取效率高，無有機溶劑殘留，產品質量好，無環境污染。本文對超臨界二氧化碳流體萃取技術從蝦青素工程番茄中提取蝦青素的工藝做了初步的探討，同時對提取物中具有高利用價值的番茄紅素、β胡蘿卜素做了分析，為利用轉基因工程番茄產業化生產蝦青素奠定了技術基礎。目前，現有技術中未見有利用超臨界二氧化碳流體萃取技術從轉基因工程番茄中提取蝦青素的方法的報道。也沒有轉基因工程番茄果實中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法的報道。

技術實現要素：
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本發明的目的在于針對現有技術存在的不足之處，提供一種利用超臨界二氧化碳流體萃取技術從轉基因工程番茄中提取蝦青素的方法，同時提供從轉基因工程番茄果實中類胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

轉基因工程番茄果實中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預先過篩的蝦青素工程番茄果實干粉,調節系統溫度和壓力至設定值,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，以1.0g/min將夾帶劑輸送到到設備中去，夾帶劑與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，然后進行皂化。

如所述的轉基因工程番茄果實中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法進一步采用皂化手段將蝦青素酯全部轉化為游離態蝦青素，將蝦青素工程番茄的萃取液進行皂化，取1ml提取液，利用濃縮儀濃縮干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混勻，0℃黑暗環境中反應15min，加入2ml10％nacl混勻，2000g離心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗兩遍，溶于1ml丙酮溶液，抽濾后上樣測定色素含量。

如所述的轉基因工程番茄果實中蝦青素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，取預先過篩的番茄果實干粉,調節系統溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設備中去，無水乙醇與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，動態萃取時間為2h。

轉基因工程番茄果實中的類胡蘿卜素超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預先過篩的番茄果實干粉,調節系統溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設備中去，無水乙醇與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，動態萃取時間為2h。

如所述的轉基因工程番茄果實中的類胡蘿卜素超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法進一步對類胡蘿卜素含量進行定量測定，所述的類胡蘿卜素為蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素，其定量測定方法采用：準確稱取蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素標準品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分別定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml標準品混合樣，利用uplc上樣制作標準曲線，計算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量，所述的uplc方法為：流速：1ml/min；進樣量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，異丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；

轉基因工程番茄果實中番茄紅素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預先過篩的番茄果實干粉,調節系統溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設備中去，無水乙醇與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，動態萃取時間為2h。

轉基因工程番茄果實中β胡蘿卜素的超臨界二氧化碳流體萃取方法，該方法包括取預先過篩的番茄果實干粉,調節系統溫度至50℃，萃取壓力

35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設備中去，無水乙醇與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，動態萃取時間為2h。

本發明是利用超臨界二氧化碳流體萃取技術從轉基因工程番茄中提取蝦青素。在發明中，萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，萃取2h的情況下，蝦青素的提取率可達95％，此方法用料安全，提取率高，非常適合轉基因工程番茄蝦青素的提取。此外，轉基因工程番茄中含有高營養價值的番茄紅素及β胡蘿卜素等類胡蘿卜素，在蝦青素的最佳提取條件下，番茄紅素提取率為82％，β胡蘿卜素提取率為89％。本研究為轉基因工程番茄產業化提取蝦青素奠定了技術基礎。

附圖說明：

圖1不同夾帶劑對蝦青素提取率的影響；

圖2萃取溫度對蝦青素提取率的影響；

圖3萃取壓力對蝦青素提取率的影響；

圖4萃取時間對蝦青素提取率的影響；

圖5轉基因工程番茄果實類胡蘿卜素色譜圖。

具體實施方式：

下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。

實施例1：

材料和方法

材料和設備：

無水乙醇,75％乙醇，乙酸乙酯，丙酮，正己烷均為國產分析純；異丙醇、乙腈、甲醇為德國fisher色譜純；超臨界二氧化碳流體萃取裝置,美國waters(tharsfe)；超高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司，1290infinity；色譜柱，美國安捷倫科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm；旋轉蒸發儀,東京理化，eyelen-1100；分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司，tp-213。

番茄果實干粉：蝦青素工程番茄(黃俊潮等(huangjc等，2013)通過基因工程方法將綠藻中篩選和分離到能催化植物細胞中β-胡蘿卜素和玉米黃素成蝦青素的酮化酶和羥化酶基因轉入野生型番茄植株(cv.uc82b)中，得到的轉基因番茄(已于2014年5月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：cgmccno9223號，分類命名：蝦紅1號轉基因番茄。)f4番茄干粉，過篩200目。

方法：

超臨界二氧化碳流體萃取方法：每次取預先過篩的蝦青素工程番茄果實干粉200g,調節系統溫度和壓力至設定值,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，以1.0g/min將夾帶劑輸送到到設備中去，夾帶劑與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取。本研究將對萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑、萃取時間進行考察，根據蝦青素的提取率確定最佳萃取條件，在考察一個參數時，設定其他參數不變。

蝦青素皂化方法：蝦青素在轉基因番茄果實中一部分是以蝦青素酯的形式存在，因此需要采用皂化手段將蝦青素酯全部轉化為游離態蝦青素。具體方法是：取1ml超臨界二氧化碳流體萃取方法所得蝦青素萃取液，利用濃縮儀濃縮干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混勻，0℃黑暗環境中反應15min，加入2ml10％nacl混勻，2000g離心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗兩遍，溶于1ml丙酮溶液，抽濾后上樣測定色素含量。

蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的定量方法如下：準確稱取蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素標準品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分別定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml標準品混合樣，利用uplc上樣制作標準曲線，計算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量。uplc方法：流速：1ml/min；進樣量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，異丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，異丙醇：5％，甲醇：15％；

結果與分析

不同夾帶劑對蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察夾帶劑的影響時，選定其他參數為：萃取溫度35℃，萃取壓力35mpa，萃取時間3h。分別用50％乙醇，75％乙醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作為夾帶劑進行試驗。測定蝦青素提取率，結果如圖1。

由圖1可以看出，用無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作為夾帶劑時，蝦青素提取率均較高。這說明，在超臨界狀態下，二氧化碳流體的極性非常小，而夾帶劑的加入，特別是高極性的夾帶劑，有利于蝦青素溶解于超臨界二氧化碳流體中。但丙酮、乙酸乙酯是有機溶劑，殘留難以完全去除，而無水乙醇不但安全，而且成本低，提取率相對較高，因此可以選擇無水乙醇作為最佳夾帶劑。

萃取溫度對蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察溫度的影響時，選定其他參數為：萃取壓力35mpa，萃取時間3h，夾帶劑無水乙醇，在此實驗條件設定溫度30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃。測定蝦青素提取率，結果如圖2。

由圖2可以看出，蝦青素的提取率隨溫度的升高而升高，溫度為50℃時達到最大，之后，提取率隨溫度的升高而降低。這可能由于，當溫度升高，蒸氣壓增大，使蝦青素在超臨界二氧化碳流體中的溶解度增大，但當溫度繼續升高時由于游離態蝦青素在高溫環境下容易受熱分解從而導致提取率降低。因此，超臨界二氧化碳流體萃取蝦青素的最佳溫度為50℃。

萃取壓力對蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察壓力的影響時，選定其他實驗參數為：溫度50℃，夾帶劑無水乙醇，萃取時間3h，，在此實驗條件設定壓力10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃。測定蝦青素提取率，結果如圖3。

由圖3可以看出，蝦青素的提取率隨著萃取壓力的增高而增加，壓力35mpa時，提取率為90％，壓力40mpa時，提取率為92％。這說明當壓力增高，流體密度增加，引起萃取物在超臨界二氧化碳流體中的溶解度提高，致使萃取蝦青素提取率增加。雖然壓力越高，越有利于提取率的提高，但由于實驗設備限制，并且在生產應用中，壓力的過高會導致設備壽命降低，增加運營成本，因此采用35mpa為最佳萃取壓力。

萃取時間對蝦青素提取率的影響：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，考察萃取時間的影響時，選定其他實驗參數為：萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，夾帶劑為無水乙醇；分別萃取1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h，3.5h，4.0h。測定蝦青素提取率，結果如圖4。

由圖4可以看出，蝦青素的提取率隨著萃取時間的增加而增加，2.5h時提取率達到最大，在4h時提取率急劇下降，這可能是由于熱敏性的蝦青素在長時間處于萃取溫度50℃，35mpa的條件下，蝦青素受熱分解造成的。因此2.5h為最佳萃取時間。

番茄果實中類胡蘿卜素含量比較分析：

在超臨界二氧化碳流體萃取過程中，在考察果實中類胡蘿卜素含量及提取率時，設定實驗參數為蝦青素的最佳提取條件：萃取溫度50℃，萃取壓力35mpa，無水乙醇萃取2h，分別計算蝦青素、番茄紅素、β胡蘿卜素的含量及提取率。

從圖5、表1可以看出，轉基因工程番茄果實中不僅含有蝦青素，還有番茄紅素及β胡蘿卜素。蝦青素的提取率為95％，含量為1.90mg/g干重，番茄紅素提取率為82％，含量為0.74mg/g干重，β胡蘿卜素的提取率為89％，含量為0.85mg/g干重。

表1轉基因工程番茄果實類胡蘿卜素含量

本發明的最佳技術方案：

取預先過篩的番茄果實干粉200g,調節系統溫度至50℃，萃取壓力35mpa,待萃取釜的溫度及壓力達到設定值且穩定后，進行1h的靜態萃取；靜態萃取結束后打開平流泵，將無水乙醇輸送到到設備中去，無水乙醇與二氧化碳氣體的混合流體進入萃取釜，開始動態萃取，動態萃取時間為2h，蝦青素的提取率為95％。在此萃取條件下萃取蝦青素的同時，本發明同時還得到高價值的番茄紅素、β胡蘿卜素，其提取率分別為82％和89％。