本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種吡咯并嘧啶酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由于胰島素的絕對(duì)或相對(duì)不足造成血糖升高，從而引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，最終導(dǎo)致病人的致殘或致死。臨床上將糖尿病分為1型與2型。1型糖尿病是由于胰島β-細(xì)胞被破壞，缺乏胰島素分泌，從而引發(fā)血糖升高，這類患者只能依賴于外源性胰島素；II型糖尿病是由于胰島素分泌相對(duì)不足或胰島素作用環(huán)節(jié)不健全引發(fā)高血糖，它的發(fā)病率約占所有糖尿病患者人數(shù)的90％以上。目前的藥物研究主要是針對(duì)于2型糖尿病(T2DM)展開的。促進(jìn)胰島β-細(xì)胞分泌胰島素是治療T2DM的主要手段，但傳統(tǒng)降糖藥物胰島素增敏劑(如雙胍類，噻唑烷二酮類等)和胰島素促分泌劑(如磺酰脲類和非磺酰類藥物)等在治療的同時(shí)，往往導(dǎo)致低血糖、增加體重、引發(fā)心血管的病態(tài)反應(yīng)和β-細(xì)胞死亡等副作用。因此，如何減少并發(fā)癥和不良副作用，已是治療T2DM的主要方向。胰高血糖素樣肽酶-1(GLP-1)是一種內(nèi)源性的激素，隨著餐后血糖的升高，由小腸中的L細(xì)胞分泌產(chǎn)生，進(jìn)而刺激胰島素的分泌。因此，GLP-1的分泌與血糖的攝入量密切相關(guān)。基于GLP-1的治療方案可以有效地控制血糖而不增加體重，不會(huì)產(chǎn)生低血糖等不良反應(yīng)。GLP-1作為二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的底物，半衰期很短，分泌后1-2分鐘之內(nèi)就會(huì)被DPP-IV迅速剪切失活。研究顯示，DPP-IV對(duì)底物的剪切部位恒定，均為其N端倒數(shù)第二位的脯氨酸或丙氨酸。如果抑制DPP-IV的活性，就會(huì)間接的提高體內(nèi)GLP-1的含量，從而引起體內(nèi)一系列的生理，刺激胰島素的分泌，達(dá)到治療T2DM的目的。DPP-IV抑制劑作為一種新的口服抗糖尿病藥物，能夠阻止腸降血糖素激素的快速降解，提高餐后GLP-1的水平，毒副作用小，藥效明顯，無(wú)論是單獨(dú)給藥還是聯(lián)合用藥，發(fā)生低血糖的風(fēng)險(xiǎn)很小，至今為止是比較安全有效的藥物，已經(jīng)成為治療T2DM的一個(gè)新選擇。目前，DPP-IV抑制劑的研究已取得較大的突破，上市的藥物有默克公司的Sitagliptin、諾華公司的Vildagliptin、百時(shí)美施貴寶公司的Saxagliptin、武田公司的Alogliptin和勃林格殷格翰公司的Linagliptin等，同時(shí)還有數(shù)十個(gè)品種處于臨床研究階段。2015年3月，武田公司的Trelagliptin獲準(zhǔn)在日本上市，它是一個(gè)長(zhǎng)效DPP-IV抑制劑，每周口服一次，而市場(chǎng)上同類DPP-4抑制劑需要每天口服一次。同時(shí)，默克公司也正在開發(fā)一款長(zhǎng)效DPP-4抑制劑Omarigliptin，試驗(yàn)顯示每周口服一次，目前該藥物臨床試驗(yàn)已獲得成功，并已在日本申請(qǐng)上市批準(zhǔn)。長(zhǎng)效DPP-IV抑制劑的用藥優(yōu)勢(shì)無(wú)疑將為糖尿病患者提供了更為方便的治療選擇，有望大幅改善患者的便利性和依從性，將成為DPP-IV抑制劑研究的新方向。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明提供一種吡咯并嘧啶酮類化合物，該類化合物是一種有效的DPP-IV抑制劑，能夠有效降低血糖，同時(shí)不引起體重增加和低血糖等風(fēng)險(xiǎn)，且能達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間控制血糖的治療效果。一種具有式I結(jié)構(gòu)特征的吡咯并嘧啶酮類化合物或其或其藥學(xué)上可接受的鹽：其中：R1選自：氫、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C3～C7環(huán)烴基、4～7元雜環(huán)基、C1～C4烷基?；?、C1～C4烷基磺?；?、芳基、芐基、芳基?；?、芳基磺?；?、芳基酰基亞甲基、5～7元雜芳基、5～7元雜芳基亞甲基、5～7元雜芳基?；?～7元雜芳基磺?；?、5～7元雜芳基?；鶃喖谆?；R2、R3分別獨(dú)立地選自：氫、鹵素、氰基、硝基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C3～C7環(huán)烴基、4～7元雜環(huán)基、C1～C4烷基?；?、C1～C4烷基磺?；4R5N、R4RsNCO、R4R5NSO2、C3～C7環(huán)胺基、C3～C7環(huán)胺基?；3～C7環(huán)胺基磺?；?～7元雜環(huán)胺基、5～7元雜環(huán)胺?；?～7元雜環(huán)胺磺?；⒎蓟?、芐基、芳基?；?、芳基磺酰基、芳基酰基亞甲基、5～7元雜芳基、5～7元雜芳基亞甲基、5～7元雜芳基酰基、5～7元雜芳基磺酰基、5～7元雜芳基酰基亞甲基；R4、R5分別獨(dú)立地選自：氫、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C3～C7環(huán)烴基、4～7元雜環(huán)基、C1～C4烷基酰基、C1～C4烷基磺?；1～C4烷基?；鶃喖谆?、芳基、芐基、芳基?；?、芳基磺?；?、芳基?；鶃喖谆?、5～7元雜芳基、5～7元雜芳甲基、5～7元雜芳?；?、5～7元雜芳磺酰基或5～7元雜芳?；鶃喖谆?。并且R1～R5中：所述雜環(huán)基和所述雜芳基含1～3個(gè)選自氧、硫和氮中的雜原子；所述C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C1～C4烷基?；?、C1～C4烷基磺?；?～7元雜環(huán)胺基的碳上的氫、5～7元雜環(huán)胺酰基的碳上的氫、5～7元雜環(huán)胺磺?；奶忌系臍渚杀灰粋€(gè)或多個(gè)R11所取代或未取代；所述R11可相同或不同的選自：鹵素、羰基、羥基、氨基、硝基、巰基、氰基、C1～C3烷磺基、C1～C3烷氧基；所述C3～C7環(huán)烴基、4～7元雜環(huán)基的碳上的氫、C3～C7環(huán)胺基、C3～C7環(huán)胺基?；3～C7環(huán)胺基磺?；⒎蓟?、芐基、芳基?；?、芳基磺?；?、芳基?；鶃喖谆?、5～7元雜芳基、5～7元雜芳基亞甲基、5～7元雜芳基?；?、5～7元雜芳基磺酰基、5～7元雜芳基酰基亞甲基均可被一個(gè)或多個(gè)R12所取代或未取代；所述R12可相同或不同的選自：鹵素、羰基、羥基、氨基、硝基、巰基、氰基、C1～C6烷基、C1～C3烷磺基、C1～C3烷氧基；所述4～7元雜環(huán)基的氮上的氫、5～7元雜環(huán)胺基的氮上的氫、5～7元雜環(huán)胺?；牡系臍洹?～7元雜環(huán)胺磺?；牡系臍渚杀灰粋€(gè)或多個(gè)R13所取代或未取代；所述R13可相同或不同的選自：C1～C6烷基、C1～C6烷酰基、C1～C3烷磺基。在其中一些實(shí)施例中，選自式II結(jié)構(gòu)化合物：在其中一些實(shí)施例中，當(dāng)R2、R3選自芳基時(shí)，所述芳基選自如下取代基：當(dāng)R2、R3選自5～7元雜芳基時(shí)，所述5～7元雜芳基選自如下取代基：其中：*指取代基連接位點(diǎn)；R6、R7分別獨(dú)立地選自：鹵素、羥基、氨基、硝基、巰基、C1～C6烷磺基、氰基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷烴氧基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷烴氧甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、CBr2H、CCl2H、CF2H、C1～C4?；?、芳基和C5～C7雜芳基。在其中一些實(shí)施例中，R1選自：氫、甲烷磺?；⑵S基；R2選自：氫、鹵素；R3選自：氫、鹵素、芳基、5～7元雜芳基。所述芳基選自如下取代基：所述5～7元雜芳基選自如下取代基：其中：R6、R7分別獨(dú)立地選自：鹵素、羥基、氨基、硝基、巰基、C1～C6烷磺基、氰基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷烴氧基、C1～C6直鏈或支鏈的飽和或不飽和烷烴氧甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、CBr2H、CCl2H、CF2H、C1～C4?；⒎蓟虲5～C7雜芳基。在其中一些實(shí)施例中，R1選自：氫；R2選自：氫。在其中一些實(shí)施例中，選自如下化合物：本法明還公開了上述的吡咯并嘧啶酮類化合物的制備方法，按照下述線路合成：其中：R1、R2、R3定義如權(quán)利要求1；步驟1)中，將2，4-二羥基-6-甲基嘧啶與硝酸反應(yīng)，得到化合物A，即2，4-二羥基-5-硝基-6-甲基嘧啶；步驟2)中，將化合物A與R2-CHO或反應(yīng)，得到化合物B；步驟3)中，將化合物B與酸在氯化亞錫或金屬性還原劑存在的條件下反應(yīng)，得到化合物C；所述金屬性還原劑為鋅或鐵；步驟4)中，將化合物C與三氯氧磷反應(yīng)，得到化合物D；步驟5)中，將化合物D與強(qiáng)堿性試劑反應(yīng)，得到化合物E；所述強(qiáng)堿性試劑為氫氧化鈉或氫氧化鉀；步驟6)中，將化合物E與Boc酸酐反應(yīng)，得到化合物F；步驟7)中，將化合物F與2-氰基-5-氟芐溴或2-氰基-5-氟芐氯反應(yīng)，得到化合物G；步驟8)中，將化合物G與3-氨基哌啶二鹽酸鹽反應(yīng)，得到化合物H1；步驟9)中，將化合物H1與Boc酸酐反應(yīng)，得到化合物I1；步驟10)中，將化合物I1與R1X反應(yīng)，得到化合物I2；步驟11)中，將化合物I2與N-鹵素丁二酰亞胺或鹵素反應(yīng)，得到化合物I3；步驟12)中，將化合物I3與R3B(OH)2反應(yīng)，得到化合物I4；步驟13)中，將化合物I4脫去Boc保護(hù)，得到化合物H4；步驟14)中，將化合物13脫去Boc保護(hù)，得到化合物H3；步驟15)中，將化合物12脫去Boc保護(hù)，得到化合物H2。在其中一個(gè)實(shí)施例中，具體合成步驟如下：步驟1)中，將2，4-二羥基-6-甲基嘧啶溶于濃硫酸中，加入當(dāng)量以上的發(fā)煙硝酸或硝酸鉀或鈉，5℃至室溫?cái)嚢?至5小時(shí)，反應(yīng)液邊攪拌邊慢慢加入到碎冰中，將得到對(duì)淺黃色固體抽濾，水洗并烘干得到2，4-二羥基-5-硝基-6-甲基嘧啶(化合物A)；步驟2)中，將2，4-二羥基-5-硝基-6-甲基嘧啶懸浮于正丁醇等有機(jī)溶劑，加入當(dāng)量以上的哌啶和兩當(dāng)量以上的醛，80至120℃攪拌5小時(shí)以上，減壓蒸除溶劑，加入水，將析出的固體抽濾，水洗并經(jīng)甲醇或丙酮等低沸點(diǎn)水溶性溶劑洗滌后抽干得到2，4-二羥基-5-硝基-6-取代乙烯基嘧啶類化合物B；或者將2，4-二羥基-5-硝基-6-甲基嘧啶A部分溶于DMF等有機(jī)溶劑，加入當(dāng)量以上的N，N-二甲酰胺二甲縮醛，80℃攪拌30分鐘后，再于140℃以上回流攪拌過夜，降溫加入水，將析出的固體抽濾，水洗并經(jīng)甲醇或丙酮等低沸點(diǎn)水溶性溶劑洗滌后抽干得到2，4-二羥基-5-硝基-6-N，N-二甲胺基乙烯基嘧啶B。步驟3)中，將2，4-二羥基-5-硝基-6-取代乙烯基嘧啶類化合物懸浮于DMF等有機(jī)溶劑，加入8當(dāng)量以上氯化亞錫，升溫至回流攪拌2至4小時(shí)，降溫后加入到水中，將析出的固體抽濾，水洗并經(jīng)甲醇或丙酮等低沸點(diǎn)水溶性溶劑洗滌后抽干得到6-取代吡咯[3，2-d]并嘧啶-2，4-二酮類化合物C。或者將2，4-二羥基-5-硝基-6-N，N-二甲胺基乙烯基嘧啶懸浮于醋酸中，邊攪拌邊慢慢加入鋅粉或鐵粉等金屬性還原劑，60至100℃攪拌5至20小時(shí)，降溫后反應(yīng)液直接抽濾，水洗至中性，然后加入到強(qiáng)堿性水溶液中，并攪拌使固體溶解，過濾除去不溶性鋅粉或鐵粉，濾液加入酸調(diào)至PH值為中性，將析出的固體抽濾，水洗并經(jīng)甲醇或丙酮等低沸點(diǎn)水溶性溶劑洗滌后抽干得到6-取代吡咯[3，2-d]并嘧啶-2，4-二酮C。步驟4)中，將6-取代吡咯[3，2-d]并嘧啶-2，4-二酮類化合物C懸浮于甲苯等有機(jī)溶劑，加入三氯氧磷，再慢慢加入二異丙基乙基胺等堿，回流8至24小時(shí)，冷至室溫，減壓蒸去大部分三氯氧磷，余液邊攪拌邊倒入冰水中，萃取，水洗，柱層析分離或乙醚等有機(jī)溶劑結(jié)晶得到6-R2-2，4-二氯吡咯[3，2-d]并嘧啶類化合物D；步驟5)中，將6-R2-2，4-二氯吡咯[3，2-d]并嘧啶類化合物D懸浮于2.5至3當(dāng)量氫氧化鈉或氫氧化鉀等強(qiáng)堿性水溶液中，升溫至50℃至100℃攪拌2至10小時(shí)，降至室溫，攪拌加入酸調(diào)至PH值至中性，將析出的固體抽濾，水洗，烘干得到6-R2-2-氯吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物E；步驟6)中，將6-R2-2-氯吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物E溶于DMF或DMSO等有機(jī)溶劑，加入1.0至2.0當(dāng)量三乙胺等堿和催化量DMAP，0℃至室溫滴加入1.0至2.0當(dāng)量Boc酸酐，室溫至50℃攪拌過夜，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到6-R2-2-氯-N-Boc吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物F；步驟7)中將6-R2-2-氯-N-Boc吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物F溶于乙二醇二甲醚和DMF的混合溶劑中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于-10至5℃下加入60％的NaH，攪拌至無(wú)氣體產(chǎn)生后加入無(wú)水溴化鋰，并于室溫?cái)嚢?0分鐘左右，再加入2-氰基-5-氟芐溴或2-氰基-5-氟芐氯，于40℃至100℃反應(yīng)4至18小時(shí)，冷卻至室溫后萃取，水洗，柱層析分離得到6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-氯吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物G；步驟8)中，將6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-氯吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物G溶于乙醇或異丙醇等有機(jī)溶劑中，加入3至6當(dāng)量堿和3-氨基哌啶二鹽酸鹽，90至130℃反應(yīng)5至24小時(shí)，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-氨基)哌啶吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物H1；步驟9)中，將6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-氨基)哌啶吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物H1溶于二氯甲烷或四氫呋喃等有機(jī)溶劑中，加入1至4當(dāng)量堿，加入二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)，室溫反應(yīng)2至24小時(shí)，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌啶吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I1；步驟10)中，將6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌啶吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I1溶于二氯甲烷或四氫呋喃等有機(jī)溶劑，加入堿，-5℃至室溫滴加入R1X(X＝I、Br、Cl、OTs、OTf和OMs)，室溫至回流攪拌2小時(shí)至過夜，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到5-R1-6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I2；步驟11)中，將5-R1-6-R2-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物R2溶于二氯甲烷或四氫呋喃等有機(jī)溶劑，-5℃至室溫加入N-鹵素丁二酰亞胺(鹵素為碘或溴或氯)或鹵素，0至℃室溫?cái)嚢?.5至5小時(shí)，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到5-R1-6-R2-7-鹵素取代-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物13；步驟12)中，將5-R1-6-R2-7-鹵素取代-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I3溶于四氫呋喃或1，4-二氧六環(huán)或甲苯或DMF等有機(jī)溶劑，加入堿，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入取代硼酸或硼酸酯和鈀催化劑，80至120℃攪拌2小時(shí)至過夜，降溫，萃取，水洗，干燥，柱層析分離得到5-R1-6-R2-7-R3-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I4；步驟13)-15)中，將5-R1-6-R2-7-R3-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-Boc氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物I2、I3或I4溶于氯化氫的四氫呋喃或乙酸乙酯或丙酮或乙醇或甲醇等有機(jī)溶劑，10℃至室溫?cái)嚢?至18小時(shí)，TLC(薄層色譜)檢測(cè)無(wú)原料后，減壓蒸除溶劑和過量氯化氫，加入甲醇溶解或懸浮，再加入弱堿性水溶液至PH為中性，室溫?cái)嚢璩浞趾?，萃取，飽和食鹽水洗，干燥，柱層析分離得到5-R1-6-R2-7-R3-3-(2’-氰基-5’-氟)芐基-2-(3’-氨基)哌吡咯[3，2-d]并嘧啶-4-酮類化合物H2、H3或H4。上述制備方法，各步驟中所用的酸可以是有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，所述無(wú)機(jī)酸可以是鹽酸、硫酸或磷酸，所述有機(jī)酸可以是醋酸、三氟乙酸、甲酸；堿可以是無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿，所述無(wú)機(jī)堿選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰和氫氧化鉀中的至少一種，所述有機(jī)堿選自三乙胺、吡啶、二氮雜二環(huán)(DBU)和N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)中的至少一種；所述的有機(jī)溶劑可以選自四氫呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙腈、丙酮、1，4-二氧六環(huán)、醇類、乙醚、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMA)、乙二醇二甲醚和二甲基亞砜(DMSO)中的至少一中；所述的鹵代試劑可以是鹵素或N-鹵代丁二酰亞胺(NXS，X＝I，Br，Cl)；所述硼酸試劑可以是硼酸、硼酸片那醇酯或硼酸鹽。本法明還公開了一種藥物組合物，包括作為活性成分的上述的吡咯并嘧啶酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體，可以是液體、半液體或固體形式，按照適合于所用的給藥途徑的方式配制，其可以用于體內(nèi)治療并具有生物相容性。所述藥物組合物可以按照下列給藥方式給藥：口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、口腔、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體等方式而制備成各種形式。口服組合物可以是固體、凝膠或液體。固體制劑的實(shí)例包括但不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑和散裝粉劑。這些制劑可以選擇地含有粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、甜味劑和矯味劑等。粘合劑的實(shí)例包括但不限于微晶纖維素、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠溶液、蔗糖和淀粉糊；潤(rùn)滑劑的實(shí)例包括但不限于滑石、淀粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸；稀釋劑的實(shí)例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、磷酸二鈣；助流劑的實(shí)例包括但不限于二氧化硅；崩解劑的實(shí)例包括但不限于交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、淀粉羥乙酸鈉、藻酸、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、甲基纖維素、瓊脂和羧甲基纖維素。以腸胃外給予本發(fā)明組合物，一般以注射為主，包括皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。注射劑可以被制成任何常規(guī)形式，如液體溶液或懸液、適合于在注射之前溶解或懸浮在液體中的固體形式或者乳劑?？捎糜诒景l(fā)明注射劑的藥學(xué)上可接收的載體的實(shí)例包括但不限于水性載體、非水性載體、抗微生物劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧劑、懸浮與分散劑、乳化劑、螯合劑和其它藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。水性載體的實(shí)例包括氯化鈉注射液、林格式注射液、等滲葡萄糖注射液、無(wú)菌水注射液、葡萄糖與乳酸化林格氏注射液；非水性載體的實(shí)例包括植物來(lái)源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油；抗微生物劑的實(shí)例包括間甲酚、芐醇、氯丁醇、苯扎氯銨等；等滲劑的實(shí)例包括氯化鈉和葡萄糖；緩沖劑包括磷酸鹽和檸檬酸鹽。本發(fā)明組合物還可以制備成無(wú)菌的凍干粉針劑，將化合物溶于磷酸鈉緩沖溶液，其中含有葡萄糖或其他適合的賦形劑，隨后在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下將溶液無(wú)菌過濾，繼之以冷凍干燥，得到所需的制劑。本法明還公開了上述的吡咯并嘧啶酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防受益于DPP-IV抑制的疾病藥物中的用途。所述的受益于DPP-IV抑制的疾病選自II型糖尿病、糖尿病性脂血異常、葡萄糖耐量減低(IGT)癥、禁食血漿葡萄糖減低(IFG)癥、代謝性酸中毒、酮癥、食欲調(diào)節(jié)、肥胖癥、各種癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)病癥、免疫系統(tǒng)病癥等。本法明還公開了上述的吡咯并嘧啶酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在在制備治療或預(yù)防2型糖尿病或肥胖癥藥物中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的吡咯并嘧啶酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具有新型的化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)DPP-IV具有非常好的選擇性抑制作用，在有效抑制DPP-IV活性的同時(shí)，對(duì)DPP-VIII和DPP-IX的活性幾乎沒有影響，同時(shí)鉀離子通道抑制率較低，可以預(yù)見本發(fā)明化合物開發(fā)成藥后毒性也會(huì)比較低。并且，本發(fā)明的吡咯并嘧啶酮類化合物經(jīng)初步藥效學(xué)研究顯示，與上市的每周口服一次藥物曲格列汀相比有相當(dāng)或有更高的生物利用效率，可預(yù)見本發(fā)明化合物開發(fā)后有望達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間口服一次的治療效果，大大提高患者的便利性和依從性。本發(fā)明的吡咯并嘧啶酮類化合物的制備方法，具有工藝簡(jiǎn)單，原料易得，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本發(fā)明包括式I-II化合物的游離形式，也包括其藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。當(dāng)本發(fā)明化合物具備游離堿的形式時(shí)，使化合物的游離堿形式與藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)，可以制備本發(fā)明化合物的酸加成鹽，這些鹽包括但不限于：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和苯磺酸鹽、乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽和水楊酸鹽、丙二酸鹽、己二酸鹽、己酸鹽、精氨酸鹽、富馬酸鹽、煙酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、草酸鹽等。當(dāng)本發(fā)明化合物具備游離酸的形式時(shí)，使其游離酸形式與藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)堿反應(yīng)可以制備本發(fā)明化合物的堿加成鹽，這類鹽包括但不限于：鋰、鈉、鉀、鋇、鈣、鎂、鋁、鐵、亞鐵、銅、鋅鹽，或與嗎啉、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三甲胺、賴氨酸或組胺酸組成的鹽。術(shù)語(yǔ)“烷基?；敝窻CO類取代基，其中，R表示烷基。術(shù)語(yǔ)“芳基?；敝窤rCO類取代基，其中，Ar表示芳基。術(shù)語(yǔ)“烷基磺?；敝窻SO2類取代基，其中，R表示烷基。術(shù)語(yǔ)“芳基磺?；敝窤rSO2類取代基，其中，Ar表示芳基。術(shù)語(yǔ)“芳基?；鶃喖谆敝窤rCOCH2類取代基，其中，Ar表示芳基。除在文獻(xiàn)中已知的或在實(shí)驗(yàn)程序中例證的標(biāo)準(zhǔn)方法外，可采用如下實(shí)施例中的方法制備本發(fā)明化合物。結(jié)合下述的合成方案，能夠?qū)Ρ景l(fā)明中所述的化合物以及合成方法進(jìn)行更好的理解。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。所述的合成方案描述了可以用于制備本發(fā)明中所述的化合物的方法，所述的方法僅僅是為說明目的的說明性方案描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明所具有的范圍的限制。樣品的分析數(shù)據(jù)由以下儀器測(cè)定：核磁共振由BrukerAMX-400型核磁共振儀測(cè)定，TMS(四甲基硅烷)為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移單位為ppm，耦合常數(shù)單位為Hz：質(zhì)譜由Agilent1200/MSD質(zhì)譜儀測(cè)定。柱層析用硅膠200-300目(青島海洋化工廠生產(chǎn))；TLC硅膠板為煙臺(tái)化工廠生產(chǎn)的HSGF-254型薄層層析預(yù)制板；石油醚沸程為60-90℃；采用紫外燈，碘缸顯色。除另有說明外，以下實(shí)施例中使用的初始原料、反應(yīng)試劑等均為市售產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)中所用試劑及溶劑均按反應(yīng)具體情況處理。本發(fā)明中使用的試劑縮寫字母為本領(lǐng)域常用的表達(dá)方式，含義如下：DCM：二氯甲烷DIEA：N，N-二異丙基乙胺DMA：N，N-二甲基乙酰胺DME：乙二醇二甲醚DMF：N，N-二甲基甲酰胺EA：乙酸乙酯NBS：N-溴代丁二酰亞胺PE：石油醚TEA：三乙胺THF：四氫呋喃GP-AMC：甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-三氟甲基香豆素實(shí)施例1.化合物1的合成。按照以下合成路線進(jìn)行：1)化合物1-1的合成：在100mL茄形瓶中加入520ml濃硫酸，冰浴下分批加入140g6-甲基脲嘧啶，保持溫度不超過40℃。待全部溶解后，緩慢滴加104ml發(fā)煙硝酸，保持溫度不超過15℃。滴加完畢，室溫?cái)嚢?0min后，將反應(yīng)液倒入碎冰中，有固體洗出。抽濾，濾餅經(jīng)水、丙酮洗后晾干，即得到目標(biāo)化合物1-1。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.79(1H，s)，11.76(1H，s)，2.28(3H，s)。2)化合物1-2的合成：在1000mL兩頸瓶中加入119g化合物1-1和400mLN，N-二甲基甲酰胺，油浴80℃加熱攪拌25min后加入160mLN，N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛，升溫至140℃加熱攪拌30min后，冰浴冷卻，析出固體，抽濾，濾餅依次用乙酸乙酯、乙醚洗后晾干即得目標(biāo)化合物1-2。MS：227.0，228.0[M+1]+。3)化合物1-3的合成：在100mL茄形瓶中加入1.43g化合物1-2和23ml醋酸，油浴加熱至80℃后分批加入2g鋅粉。加畢，油浴80℃加熱1小時(shí)后將反應(yīng)液冷卻至室溫，有固體析出。抽濾，濾餅經(jīng)醋酸、水洗后用10ml5％氫氧化鈉溶液溶解。該溶液70℃加熱攪拌30min后，滴加醋酸至pH5-6。抽濾，濾餅經(jīng)冷水、乙醇洗后晾干即得到目標(biāo)物1-3。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.82(1H，s)，10.75(1H，s)，10.56(1H，s)，7.12-7.13(1H，t，J＝3Hz)，5.83-5.84(1H，t，J＝2Hz)。4)化合物1-4的合成：在100ml茄形瓶中加入0.38g化合物1-3和30ml三氯氧磷，油浴120℃加熱6小時(shí)后，冷卻到室溫，減壓蒸出三氯氧磷，殘余物在冰浴條件下滴加30mL冷的氨水至pH8。加畢，繼續(xù)攪拌30min，抽濾，濾餅經(jīng)冷水洗后真空干燥即得到目標(biāo)物1-4。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.72(1H，s)，8.06-8.07(1H，d，J＝4Hz)，6.68-6.69(1H，d，J＝4Hz)。5)化合物1-5的合成：室溫下，將化合物1-4(5.00g，26.6mmol)溶解在1mol/L的氫氧化鈉水溶液(50ml)中，80℃攪拌12小時(shí)。反應(yīng)完畢，降至室溫，冰浴條件下，滴加稀鹽酸調(diào)至中性，將沉淀過濾，水洗濾餅，抽干得灰白色固體化合物1-5，稱重4.30g，收率95.3％。MS：170.0[M+H+]。6)化合物1-6的合成：室溫下，將化合物1-5(3.02g，17.8mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入吡啶(2.11g，26.7mmol)，滴加入Boc2O(5.82g，26.7mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)完畢，反應(yīng)液直接加入到飽和食鹽水中，將沉淀過濾，水洗濾餅，抽干得黃色固體即為化合物1-6，稱重4.00g，收率83.4％。MS：270.1[M+H+]。7)化合物1-7的合成：室溫下，將化合物1-6(3.86g，14.3mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺/乙二醇二甲醚＝5∶1(20mL)中，冰浴條件下，慢慢加入60％的鈉氫(0.63g，15.7mmol)，冰浴條件下攪拌30分鐘后，慢慢加入無(wú)水溴化鋰(2.48g，28.6mmol)，慢慢升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后加入2-氰基-5-氟芐溴(3.68g，17.2mmol)，慢慢升至60℃攪拌12小時(shí)。反應(yīng)完畢，降至室溫，直接加入水(50ml)和乙酸乙酯(50ml)，萃取分層，水層再用乙酸乙酯(50ml*2)萃取兩次，合并有機(jī)層，依次用水(20ml)和飽和食鹽水(20ml)各洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸除溶劑后，用硅膠層析柱分離純化(洗脫液PE∶EA＝2∶1)，得白色固體化合物1-7，稱重2.86g，收率66.2％。MS：303.0[M+H+]。8)化合物1的合成：室溫下，將化合物1-7(0.52g，1.73mmol)混合3-氨基哌啶二鹽酸鹽(0.45g，2.60mmol)、碳酸氫鈉(0.58g，6.92mmol)和4A分子篩(0.50g)，加入無(wú)水乙醇為溶劑，封入反應(yīng)管中，慢慢升溫至120℃攪拌12小時(shí)。反應(yīng)完畢，降至室溫，過濾，濾液減壓蒸除溶劑后，用硅膠層析柱分離純化(洗脫液DCM∶MeOH＝10∶1)，得無(wú)色油狀化合物1，稱重0.35g，收率55.6％。MS：367.2[M+H+]。實(shí)施例2.化合物2的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物2-1：將化合物1-7(303mg，1.0mmol)溶于20mL的THF，0℃氮?dú)獗Ｗo(hù)加入60％鈉氫(48mg，1.2mmol)，攪拌至無(wú)氣體產(chǎn)生，慢慢滴加入甲磺酰氯(137mg，1.1mmol)，漸漸升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)液加入50mL水，然后用3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物2-1，收率88％；MS：381.0[M+H+]。2)合成化合物2：以上步驟得到的化合物2-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物2，收率63％；MS：445.1[M+H+]。實(shí)施例3.化合物3的合成按照以下合成路線進(jìn)行：以化合物1-7為原料，2-氰基-5-氟芐溴替代甲磺酰氯，參考實(shí)施例2的合成方法，合成化合物3，收率53％；MS：500.2[M+H+]。實(shí)施例4.化合物4的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物4-1：將化合物3-1(436g，1.0mmol)溶于20mL二氯甲烷，室溫加入N-氯代丁二酰亞胺(200g，1.5mmol)，漸漸升至回流攪拌5小時(shí)，降溫后反應(yīng)液加入20mL水，然后用3×100mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物4-1，收率53％；MS：470.0[M+H+]。2)合成化合物4：以上步驟得到的化合物4-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物4，收率68％；MS：534.1[M+H+]。實(shí)施例5.化合物5的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物5-1：將化合物1-7(436mg，1.0mmol)溶于20mL乙腈，室溫加入1-氯甲基-4-氟-1，4-重氮化二環(huán)-2.2.2-辛烷雙(四氟硼酸)鹽(SelectF)(708mg，2.0mmol)和無(wú)水氯化鋯(932mg，4.0mmol)，漸漸升至80℃攪拌過夜，降溫后反應(yīng)液加入50mL冷水，然后用3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物5-1，收率37％；MS：321.0[M+H+]。2)合成化合物5：以上步驟得到的化合物5-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物5，收率57％；MS：385.1[M+H+]。實(shí)施例6.化合物6的合成按照以下合成路線進(jìn)行：以化合物1-7為原料，參考實(shí)施例5的合成方法，1-氯甲基-4-氟-1，4-重氮化二環(huán)-2.2.2-辛烷雙(四氟硼酸)鹽(SelectF)選用5當(dāng)量，回流反應(yīng)24小時(shí)，合成化合物6-1及化合物6，總收率23％；MS：500.2[M+H+]。實(shí)施例7.化合物7的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物7-1：將化合物1-7(436mg，1.0mmol)溶于20mL二氯甲烷，室溫加入N-氯代丁二酰亞胺(173mg，1.3mmol)，漸漸升至回流攪拌過夜，降溫后反應(yīng)液加入30mL水，然后用3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物7-1，收率43％；MS：337.0[M+H+]。2)合成化合物7：以上步驟得到的化合物7-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物7，收率56％；MS：401.1[M+H+]。實(shí)施例8.化合物8的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物8-1：將化合物1-7(436mg，1.0mmol)溶于20mL二氯甲烷，0℃加入N-溴代丁二酰亞胺(195mg，1.1mmol)，漸漸升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)液加入30mL飽和亞硫酸氫鈉水溶液，攪拌30分鐘，然后用3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物8-1，收率78％；MS：381.0[M+H+]。2)合成化合物8：以上步驟得到的化合物8-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物8，收率60％；MS：445.0[M+H+]。實(shí)施例9.化合物9的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物9-1：將化合物1-7(436mg，1.0mmol)溶于20mL二氯甲烷，0℃加入N-溴代丁二酰亞胺(445mg，2.5mmol)，漸漸升至室溫?cái)嚢柽^夜，反應(yīng)液加入30mL飽和亞硫酸氫鈉水溶液，攪拌30分鐘，然后用3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，快速柱層析分離得到化合物9-1，收率89％；MS：460.9[M+H+]。2)合成化合物9：以上步驟得到的化合物9-1為原料，參考實(shí)施例1中化合物1的合成方法，合成化合物9，收率64％；MS：525.0[M+H+]。實(shí)施例10.化合物10的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物10-1：將化合物8(445mg，1mmol)溶于50mL四氫呋喃中，加入三乙胺(121mg，1.2mmol)，然后滴加入Boc酸酐(240mg，1.1mmol)，室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)液加入30mL水，然后用3×100mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到黃色固體化合物10-1，收率91％；MS：545.1[M+H+]。2)合成化合物10-2：將上步驟得到的化合物10-1(545mg，1mmol)溶于的20mL比例為10∶1的1，4-二氧六環(huán)/水中，加入3-噻吩硼酸(154mg，1.2mmol)和碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入[1，1′-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物(dppf.PdCl2.DCM)(65mg，0.08mmol)，封管100℃攪拌過夜，降溫，加入30mL水，3×80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和NaHCO3水溶液、水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到化合物10-2，收率82％；MS：549.2[M+H+]。3)合成化合物10：將上步驟得到的化合物10-2(548mg，1mmol)溶于20mL飽和氯化氫甲醇溶液，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，減壓蒸除溶劑和過量氯化氫，加入20mL甲醇溶解，滴加入飽和碳酸鈉水溶液并攪拌至PH為中性，3*80mL乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，水和飽和食鹽水依次洗滌洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到化合物10，收率86％；MS：449.1[M+H+]。實(shí)施例11.化合物11的合成以化合物10-1為原料，用2-噻吩硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物11，收率64％；MS：449.1[M+H+]。實(shí)施例12.化合物12的合成以化合物10-1為原料，用2-甲砜基苯硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物12，收率72％；MS：521.2[M+H+]。實(shí)施例13.化合物13的合成以化合物10-1為原料，用3-甲砜基苯硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物13，收率70％；MS：521.2[M+H+]。實(shí)施例14.化合物14的合成以化合物10-1為原料，用4-氟苯硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物14，收率76％；MS：461.2[M+H+]。實(shí)施例15.化合物15的合成以化合物10-1為原料，用4-甲磺?；脚鹚崽娲?-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物15，收率67％；MS：521.2[M+H+]。實(shí)施例16.化合物16的合成以化合物10-1為原料，用4-異丙磺?；脚鹚崽娲?-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物16，收率63％；MS：549.2[M+H+]。實(shí)施例17.化合物17的合成以化合物10-1為原料，用4-胺磺?；脚鹚崽娲?-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物17，收率56％；MS：522.2[M+H+]。實(shí)施例18.化合物18的合成以化合物10-1為原料，用2-氟-4-甲磺酰苯硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物18，收率53％；MS：539.2[M+H+]。實(shí)施例19.化合物19的合成以化合物10-1為原料，用3-氟-4-甲磺酰苯硼酸替代3-噻吩硼酸，參考實(shí)施例10的合成方法，合成化合物19，收率58％；MS：539.2[M+H+]。實(shí)施例20.化合物20的合成按照以下合成路線進(jìn)行：1)合成化合物20-1：將實(shí)施例1所得的化合物1-1(17.1g，100mmol)懸浮于200mL正丁醇，加入哌啶(17.0g，200mmol)和2-噻吩甲醛(22.4g，200mmol)，回流攪拌過夜，減壓蒸除溶劑，加入500mL水，充分?jǐn)嚢?，將析出的固體過濾，一次用水和丙酮洗滌，抽干得到化合物20-1，收率85％；MS：266.0[M+H+]。2)合成化合物20-2：將上步驟得到的化合物20-1(13.3g，50mmol)懸浮于100mL的DMF，加入氯化亞錫(75.8g，400mmol)，升溫至回流攪拌4小時(shí)，降至室溫，加入到500mL水中，攪拌并將析出的固體過濾，依次用水和丙酮洗滌，抽干得到化合物20-2，收率62％；MS：234.0[M+H+]。3)合成化合物20：參考實(shí)施例1中合成化合物1的方法，以化合物20-2替代化合物1-3為原料，合成化合物20，總收率13％；MS：449.1[M+H+]。實(shí)施例21體外活性實(shí)驗(yàn)本發(fā)明提供的化合物對(duì)DPP-IV的抑制率可以用DPP-IV-GloTM蛋白水解酶的均相發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(DPP-IV-GloTMProteaseAssay，Promegacat#G8350)測(cè)得。該系統(tǒng)含有DPP-IV底物Gly-Pro-氨基螢光素和螢光素酶活性檢測(cè)的緩沖液系統(tǒng)，檢測(cè)原理為：DPPIV-GloTM被DPP-IV切割后會(huì)激活螢光素酶反應(yīng)，產(chǎn)生“glow-type”型發(fā)光信號(hào)，再用TurnerVeritasTM微孔板發(fā)光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)即可表征DPP-IV的活性。1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)DPP-IV酶的抑制活性以及選擇性抑制作用。2、實(shí)驗(yàn)材料DPP-IV酶、DPP-VIII酶、DPP-IX酶、GP-AMC(BioMol)、黑色96孔板、超級(jí)酶標(biāo)儀；DPP-IV和DPP-VIII的分析緩沖液：100mmol/lTris/HClbuffer，pH8.0，0.1mg/mlBSA；DPP-IX的分析緩沖液：100mmol/lTris/HClbuffer，pH7.4，0.1mg/mlBSA。3、實(shí)驗(yàn)方法a、酶活性的確定：將GP-AMC稀釋于各自的緩沖液中，濃度為100umol/L，每孔25μl；酶梯度稀釋，起始濃度分別為DPP-VIII、DPP-IX：0.01ug/ul，DPP-IV：0.01mU/ul，按5倍稀釋，每孔25μl，混勻；37℃，360/460nm測(cè)定熒光值的動(dòng)態(tài)變化，測(cè)定30分鐘；以吸光度呈直線上升、S/B≥5的酶濃度為使用濃度。b、抑制劑活性測(cè)定：所有酶、抑制劑、GP-AMC均用分析緩沖液配制，設(shè)置無(wú)化合物對(duì)照、無(wú)酶液對(duì)照。按酶的使用濃度配制酶液，每孔25μl；梯度稀釋抑制劑(10倍或5倍稀釋)，每孔25μl，混勻；加入稀釋好的GP-AMC溶液50μl，混勻；37℃反應(yīng)20分鐘，360/460nm測(cè)定熒光值。c、數(shù)據(jù)分析：用GraphPad-Prism軟件分析。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明化合物1-22對(duì)三種酶的抑制活性數(shù)據(jù)如下表所示。表1.體外活性與選擇性數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：與對(duì)照藥相比，本發(fā)明化合物對(duì)DPP-IV具有非常好的選擇性抑制作用，化合物對(duì)DPP-IV的抑制率均與對(duì)照藥相當(dāng)或更好。表中數(shù)據(jù)還顯示，在有效抑制DPP-IV活性的同時(shí)，本發(fā)明化合物對(duì)DPP-VIII和DPP-IX的活性幾乎沒有影響，可以預(yù)見本發(fā)明化合物開發(fā)成藥后毒性將可能比較低。實(shí)施例22小鼠體內(nèi)抑制DPP-IV活性的研究動(dòng)物：ICR小鼠(8-10周齡，性別：雄，體重25g-30g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。步驟：ICR小鼠饑餓過夜，口服給予受試化合物(3mg/kg)、陽(yáng)性要曲格列汀(3mg/kg)；同時(shí)以溶劑組為空白對(duì)照，分別與口服給藥前、給藥后7h、24h、28h、48h和52h時(shí)取從小鼠眼眶叢靜脈取血，加入經(jīng)抗凝劑處理的Eppendorf管(旗眾實(shí)業(yè)(上海)有限公司)，離心后取血漿，測(cè)定DPP-IV活性。結(jié)果：根據(jù)DPP-IV體外活性和選擇性的測(cè)試結(jié)果，共選定了2個(gè)化合物進(jìn)行了ICR小鼠體內(nèi)DPP-IV活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2所示。表2對(duì)小鼠DPP-IV酶活的抑制(％)注：Nor表示正常組。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：7h時(shí)曲格列汀對(duì)小鼠DPP-IV酶抑制剩余29％，化合物1為18％，化合物10為21％；24h時(shí)曲格列汀對(duì)DPP4酶抑制剩余79％，化合物1為56％，化合物10為70％；而48h后曲格列汀為98％，基本無(wú)抑制作用，而化合物1為79％，化合物10為88％。2個(gè)受試藥中，化合物1和10的效果均相對(duì)優(yōu)于陽(yáng)性藥曲格列汀。實(shí)施例23大鼠體內(nèi)抑制DPP-IV活性的研究動(dòng)物：SD雄性大鼠(5-7周齡，性別：雄，體重180g-220g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。步驟：SD雄性大鼠饑餓過夜，口服給予受試化合物(10mg/kg)、陽(yáng)性要曲格列汀(10mg/kg)；同時(shí)以溶劑組為空白對(duì)照，分別與口服給藥前、給藥后7h、24h、28h、48h和52h時(shí)取從大鼠眼眶叢靜脈取血，加入經(jīng)抗凝劑處理的Eppendorf管(旗眾實(shí)業(yè)(上海)有限公司)，離心后取血漿，測(cè)定DPP-IV活性。結(jié)果：根據(jù)DPP-IV體外活性和選擇性的測(cè)試結(jié)果，共選定了2個(gè)化合物進(jìn)行了ICR小鼠體內(nèi)DPP-IV活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3所示。表3對(duì)大鼠DPP-IV酶活的抑制(％)注：Nor表示正常組。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：7h時(shí)曲格列汀對(duì)大鼠DPP4酶抑制剩余5％，化合物1為10％，化合物10為11％；24h時(shí)曲格列汀對(duì)DPP4酶抑制剩余25％，化合物1為9％，化合物10為9％；48h后曲格列汀為42％，化合物10為9，％抑制作用降低一半，而化合物1為14％。2個(gè)受試藥中，化合物1效果相對(duì)優(yōu)于陽(yáng)性藥和其他化合物。本次實(shí)驗(yàn)3個(gè)受試藥中，無(wú)論作用強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間，化合物1的效果相對(duì)來(lái)說優(yōu)于其他受試藥。實(shí)施例24體外對(duì)hERG的抑制作用1.實(shí)驗(yàn)材料：受試化合物1，hERG/HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株(購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司金斯瑞)2.實(shí)驗(yàn)方法：將化合物1溶解于適量DMSO中，配制成100mM儲(chǔ)存液，溶液澄清透明；將儲(chǔ)存液分裝凍存于-70℃，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將儲(chǔ)存液用細(xì)胞外液梯度稀釋為檢測(cè)濃度。穩(wěn)定表達(dá)hERG通道的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中，在37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中放置至少24小時(shí)后用于實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)取出一個(gè)培養(yǎng)皿，用細(xì)胞外液清洗兩次，放置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，所用硼硅玻璃微電極尖端電阻為3～5MΩ。形成全細(xì)胞記錄模式后，將膜電位鉗制在-80mV，每隔30s給予細(xì)胞+50mV去極化電壓刺激，持續(xù)2s后復(fù)極化至-50mV，持續(xù)3s，即可引出hERG尾電流。去極化電壓刺激前，先給予細(xì)胞50ms，-50mV復(fù)極化電壓，該電壓下記錄的電流作為計(jì)算hERG尾電流的基線。只有達(dá)到記錄標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞才會(huì)被應(yīng)用于待測(cè)化合物的檢測(cè)。加入化合物前，hERG尾電流在細(xì)胞外液中至少穩(wěn)定記錄3分鐘。灌流給藥后當(dāng)hERG尾電流幅值變化小于＜5％時(shí)，被認(rèn)為藥物作用達(dá)到穩(wěn)態(tài)。如果電流在6分鐘內(nèi)未達(dá)到穩(wěn)態(tài)，則亦結(jié)束該濃度化合物檢測(cè)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如下表所示。表4對(duì)hERG通道的抑制(％)化合物名稱30μM抑制率(％)化合物110.94實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1對(duì)hERG的抑制較弱，可預(yù)測(cè)化合物1及專利所述化合物成藥后無(wú)心臟毒性。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3