1.一種表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體,其特征在于:所述慢病毒載體是由含有表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒穿梭表達載體pLVX和輔助包裝質粒來提供慢病毒所需的整合,逆轉錄酶和結構蛋白及外膜蛋白構建而成的。
2.根據權利要求1所述的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的構建方法,其特征在于:包括以下步驟:
S1:CD19抗體輕鏈可變區(VH)和重鏈可變區(VL)cDNA的擴增或合成
1)從雜交瘤細胞株中克隆CD19抗體輕鏈可變區(VH)和重鏈可變區(VL)cDNA,即:
a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠;
b.制備鼠抗人CD19雜交瘤細胞;
c.篩選高親和力的鼠抗人CD19雜交瘤細胞;
d.從鼠抗人CD19雜交瘤細胞中提取RNA;
e.反轉錄合成cDNA;
f.利用兼并引物擴增CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA;
g.克隆CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列;
2)根據已發表CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因;
3)CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化;
S2:CD20抗體輕鏈可變區(VH)和重鏈可變區(VL)cDNA的擴增或合成
1)從雜交瘤細胞株中克隆CD20抗體輕鏈可變區(VH)和重鏈可變區(VL)cDNA;
a.制備鼠抗人CD20雜交瘤細胞;
b.從鼠抗人CD20雜交瘤細胞中提取RNA;
c.反轉錄合成cDNA;
d.利用兼并引物擴增CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA;
e.克隆CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列;
2)根據已發表CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因;
3)CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化;
S3:鉸鏈,CD8的穿膜區,4-1BB和CD3ζ的細胞質信號轉導區cDNA合成;
S4:利用重疊拼接延伸長PCR方法將上述基因拼接起來;
S5:將拼接后的基因克隆至克隆載體并測序;
S6:將測序驗證后的基因克隆至慢病毒穿梭表達載體pLVX;
S7:按照cGMP標準制備慢病毒穿梭表達質粒和輔助包裝質粒。
3.根據權利要求1或2所述的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體,其特征在于:所述表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體能夠同時高效表達CD19和CD20嵌合抗原受體基因。
4.根據權利要求3所述的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體,其特征在于:所述表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體在3‘端具備自失活及缺失功能,以確保其安全性。
5.根據權利要求3所述的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體,其特征在于:所述表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體能夠轉化多種原代細胞及傳代細胞系。