一種表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的制作方法

本發明涉及抗體基因工程技術領域，具體涉及一種表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體及其構建方法。

背景技術：
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淋巴T細胞是構成細胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T細胞表達嵌合抗原受體能使T細胞轉化成為具有特異性殺傷腫瘤細胞的效應細胞，是一種有前景的腫瘤免疫治療策略。嵌合性抗原受體應用的關鍵是確定一種腫瘤相關抗原，這種抗原具有在腫瘤細胞表面過表達或高表達，而在正常組織無表達或低表達，CD19是表達于B淋巴細胞及濾泡樹突狀細胞的表面蛋白，屬于免疫球蛋白(Ig)超家族成員，位于16號染色體短臂上(16p11.2)，編碼556個氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。細胞外有N端及兩個C2-Ig區，一個跨膜區，細胞內有C端及含9個酪氨酸殘基的高度保守功能區。CD19在早期B細胞的發育中扮演重要的角色，所有的B細胞性急性白血病都表達CD19。CD20是一種磷酸化蛋白質分子，分子質量約為35kD，屬于4次跨膜的蛋白質超家族。它表達于90％以上的B淋巴瘤細胞和正常B淋巴細胞，而在造血干細胞、原始B淋巴細胞、正常血細胞以及其他組織上不表達。因此，CD19和CD20可作為惡性淋巴細胞白血病免疫治療的一種有效的靶抗原，構建靶向CD19和CD20嵌合抗原受體基因對于B細胞性惡性淋巴細胞白血病細胞免疫治療具有重要的臨床意義。

對于載體的選擇，目前大多數基因治療仍以病毒載體介導為主。目前，基因治療的病毒載體有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒和黃病毒等，但受到不能轉導非分裂細胞、不能穩定整合到宿主基因組、誘導宿主的免疫反應和/或依賴于輔助病毒來產生感染等限制。逆轉錄病毒載體尚存在容量有限、不易制備且穩定性差、病毒滴度低、轉基因效率不高等缺點，這大大限制了逆轉錄病毒的使用。

目前，已有4代慢病毒載體系統，其中：第一代系統主要特點是在構建包裝質粒時最大限度的減少了個包裝質粒之間的同源序列，不過保留了其輔助基因；第二代慢病毒載體在生物安全性上做了大量改進，包裝結構基因質粒上進一步刪去了編碼輔蛋白Nef、Vif、Vpr的基因；第三代載體系統其安全性又進一步提高，它刪除了病毒3′端LTR上的U3，而U3是病毒的啟動子，刪除后病毒基因組就不能復制，即使在發生病毒基因組與宿主基因組重組的情況下，病毒基因組也不能復制，因此只能轉錄整合目的基因，消除了產生活性病毒的可能性；第四代載體系統是利用分離基因的形式包裝病毒，Clontech公司的Lenti-X HTPackaging System將pol序列分離出來，使gag、pol和env成為三個有區別的獨立實體，與第三代包裝系統相比，產生病毒顆粒多需要一種重組組分，使產生具有復制能力病毒的可能性降低了一個數量級，安全性更高，并且Lenti-X HT包裝系統利用反式激活級聯反應(Tet-Off技術)來高水平表達病毒蛋白質。但第四代載體系統因為應用四種質粒，所獲的的慢病毒滴度不高。因此，亟需提供一種高效表達CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體表達系統，為抗體治療、腫瘤治療、干細胞治療的研究提供重要基礎。

技術實現要素：
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針對現有技術存在的問題，本發明的目的旨在提供一種表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體及其構建方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體，該慢病毒載體是由含有表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒穿梭表達載體pLVX和輔助包裝質粒來提供慢病毒所需的整合，逆轉錄酶和結構蛋白及外膜蛋白構建而成的。

上述表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的構建方法，包括以下步驟：

S1：CD19抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA的擴增或合成

1)從雜交瘤細胞株中克隆CD19抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA，即：

a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠；

b.制備鼠抗人CD19雜交瘤細胞；

c.篩選高親和力的鼠抗人CD19雜交瘤細胞；

d.從鼠抗人CD19雜交瘤細胞中提取RNA；

e.反轉錄合成cDNA；

f.利用兼并引物擴增CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA；

g.克隆CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列；

2)根據已發表CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因；

3)CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化；

S2：CD20抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA的擴增或合成

1)從雜交瘤細胞株中克隆CD20抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA；

a.制備鼠抗人CD20雜交瘤細胞；

b.從鼠抗人CD20雜交瘤細胞中提取RNA；

c.反轉錄合成cDNA；

d.利用兼并引物擴增CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA；

e.克隆CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列；

2)根據已發表CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因；

3)CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化；

S3：鉸鏈，CD8的穿膜區，4-1BB和CD3ζ的細胞質信號轉導區cDNA合成；

S4：利用重疊拼接延伸長PCR方法將上述基因拼接起來；

S5：將拼接后的基因克隆至克隆載體并測序；

S6：將測序驗證后的基因克隆至慢病毒穿梭表達載體pLVX；

S7：按照cGMP標準制備慢病毒穿梭表達質粒和輔助包裝質粒。

本發明構建的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體可同時高效表達CD19和CD20嵌合抗原受體基因，治療及預防因為CD19抗原丟失導致的復發，而CD20抗原不易因治療或調控降低表達。

本發明構建的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體在3‘端具備自失活及缺失功能以確保其安全性，并可轉化多種原代細胞及傳代細胞系。

本發明構建的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體，其含有的CD19和CD20嵌合抗原受體基因可將人T細胞轉化成對B細胞腫瘤具有特異性識別和殺傷的效應細胞，從而為抗體治療、腫瘤治療、干細胞治療的研究提供重要基礎，是我國血液系統腫瘤細胞治療的新方向。

附圖說明：

圖1是本發明表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的構建示意圖；

圖2是本發明實施例中重疊拼接延伸長PCR方法拼接后的基因片段的示意圖。

具體實施方式：

下面對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。

如圖1所示，表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體的構建方法，包括以下步驟：

S1：CD19抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA的擴增或合成

1)從雜交瘤細胞株中克隆CD19抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA，即：

a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠；

b.制備鼠抗人CD19雜交瘤細胞；

c.篩選高親和力的鼠抗人CD19雜交瘤細胞；

d.從鼠抗人CD19雜交瘤細胞中提取RNA；

e.反轉錄合成cDNA；

f.利用兼并引物擴增CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA；

g.克隆CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列；

2)根據已發表CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因；

3)CD19抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化；

S2：CD20抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA的擴增或合成

1)從雜交瘤細胞株中克隆CD20抗體輕鏈可變區(V_H)和重鏈可變區(V_L)cDNA；

a.制備鼠抗人CD20雜交瘤細胞；

b.從鼠抗人CD20雜交瘤細胞中提取RNA；

c.反轉錄合成cDNA；

d.利用兼并引物擴增CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA；

e.克隆CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA并測定序列；

2)根據已發表CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA序列合成基因；

3)CD20抗體輕鏈可變區和重鏈可變區cDNA的人源化優化；

S3：鉸鏈，CD8的穿膜區，4-1BB和CD3ζ的細胞質信號轉導區cDNA合成；

S4：利用重疊拼接延伸長PCR方法將上述基因拼接起來，所拼接的基因片段如圖2所示；

S5：將拼接后的基因克隆至克隆載體并測序；

S6：將測序驗證后的基因克隆至慢病毒穿梭表達載體pLVX；

S7：按照cGMP標準制備慢病毒穿梭表達質粒和輔助包裝質粒。

上述構建的表達人CD19和CD20嵌合抗原受體基因的慢病毒載體可同時高效表達CD19和CD20嵌合抗原受體基因，因此，治療及預防因CD19抗原丟失導致的復發和CD20抗原不易因治療或調控降低表達。同時，為確保其安全性，該慢病毒載體在3‘端具備自失活及缺失功能，能夠轉化多種原代細胞及傳代細胞系，將人T細胞轉化成對B細胞腫瘤具有特異性識別和殺傷的效應細胞，為抗體治療、腫瘤治療、干細胞治療的研究提供了重要基礎。