本發明涉及生物醫學材料技術領域，具體為膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法。
背景技術：
膠原蛋白(Collagen)廣泛地存在于動物骨、腱、軟骨和皮膚及其他結締組織中，是細胞外基質的主要成分，約占動物體膠原纖維固體物的85％，占體內蛋白質總量的25％～30％。膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性、細胞適應性和細胞增殖作用以及促進血小板凝聚等優異的生物學性能，目前作為生物醫學材料得到了廣泛的研究和應用。
魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，KGM)是魔芋塊莖中所含的儲備性多糖，是由葡萄糖和甘露糖主要以β-1,4糖甙鍵連接起來的中性非離子型高分子多糖，是繼淀粉和纖維素之后，一種具有應用前景的豐富的可再生天然高分子資源。KGM具有特別的物理化學性質，例如很高的黏度，良好吸水、保濕、成膜、增稠性和膠凝性；同時，KGM具有良好的生物降解性、生物相容性和一定的生物活性，具有抗腫瘤、抑制高血糖、高血脂、糖尿病、肥胖癥和抑制大腸癌變等作用。KGM的凝膠具有促進傷口愈合、止血和緩釋藥物等功能。這些性質與功能使KGM作為生物材料在生物醫學領域具有非常廣泛的應用前景。
純膠原作為生物材料存在的最大不足是其力學性能較差，需要使用交聯劑進行交聯改性以提高其機械力學性能，或者與其他類別的大分子(合成類高分子或生物大分子)共混以得到力學性能改善的復合材料。
而基于各取所長的優勢互補原理，目前，KGM作為生物醫學材料的應用也主要是與其他類別的生物大分子或合成高分子相復合而得到復合膜材料或復合水凝膠材料，或者再與仿生無機礦物成分例如羥基磷灰石相復合而得到含有包括KGM在內的兩種有機大分子的有機-無機復合凝膠材料。
在兼顧改善材料力學性能的條件下，從優良的生物相容性和生物降解性出發，更傾向于生物大分子之間的共混復合。因此，以蛋白質類的膠原和多糖類的KGM為主要成分的二元或三元復合材料也得到廣泛研究。
KGM作為生物材料的主要應用形式是制備膜類和凝膠類復合支架材料。與KGM等非離子型多糖復配制備復合支架材料的大分子分為天然生物大分子類和人工合成高分子類。天然生物大分子又分為蛋白質類和多糖類。
KGM與蛋白類大分子的復合主要與膠原復合為主，復合形式主要為膜。這種以KGM和膠原為主要成分的復合膜制備方法中，主要是基于KGM在高溫(60～90℃)和高pH值條件下發生凝膠化反應，最終得到的膜是結合有膠原分子的KGM凝膠膜[景森，陳慶華，潘興華，張峰，董會.膠原蛋白/葡甘聚糖共混膜的制備及性能表征.中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(10):1885-1888；王碧,王坤余,但衛華,張廷有,葉勇.葡甘聚糖-膠原蛋白-殼聚糖共混膜.生物醫學工程學雜志,2006,23(1)∶102～106]。這類方法中的長時間高熱高堿條件會導致膠原蛋白分子的變性，從而會使膠原分子失去本身的生物活性。這是該類方法對于保持蛋白類生物大分子的生物活性方面所存在的關鍵性不足。
也有KGM與大豆蛋白相復配成膜或成凝膠的，但所用的大豆蛋白是已經發生了變性的。該復合凝膠的形成機理是KGM分子與變性大豆蛋白的伸展分子鏈間形成的氫鍵增強產生的協同增效作用[丁金龍,孫遠明，樂學義.魔芋膠與大豆分離蛋白相互作用研究,中國糧油學報,2003,18(3):65-69]。有以KGM、大豆分離蛋白(SPI)和膠原蛋白為主要原料，配以甘油、單甘脂等其他物質研制成復合眼貼膜，雖然該膜制備過程所用的pH值屬弱堿范圍，但仍然是在高溫(75℃和45℃)條件下完成各成分的復合和膜的干燥的[潘廷跳，張俊明，潘振華，蘇晨帆，龐杰.復含眼貼膜的研制.日用化學品科學,2012,35(3):31-35]。這樣的溫度足以使膠原分子變性失活。
也有將KGM與其他多糖類大分子，如卡拉膠、黃原膠以及普魯蘭多糖(Pullulan,PULL)等共混以制備復合凝膠支架材料。但KGM與卡拉膠或黃原膠類別多糖的共混復合凝膠的生成原理是基于卡拉膠分子或黃原膠分子在高溫作用下(分別不低于74℃和42℃)從有序態轉變為無規線團態后與KGM分子鏈發生絞合而生成凝膠網絡骨架；而由于普魯蘭多糖是粘度低不具有凝膠性的多糖，其與KGM的復合凝膠的制備則需要依賴于90℃高溫的堿熱處理以實現KGM分子的熱不可逆凝膠化以形成KGM-PULL復合凝膠[何東保,彭學東,詹東風.卡拉膠與魔芋葡甘聚糖協同相互作用及其凝膠化的研究.高分子材料科學與工程，2001，17(2)：28-30；何東保,楊朝云，詹東風,黃原膠與魔芋膠協同相互作用及其凝膠化的研究.武漢大學學報(自然科學版)，1998，44(2)：198-200；寇丹丹，蘭潤，葉偉建,薛麗華，魏雪琴，龐杰.魔芋葡甘聚糖/普魯蘭多糖半互穿網絡水凝膠彈性及其微觀形貌研究.西南大學學報(自然科學版).2014,36(4):205-212]。以上方法中的高溫高堿的嚴苛條件顯然是不適于膠原等蛋白質類的生物活性大分子的復合的。
在KGM與透明質酸(hyaluronic acid,HA)的共混復合中，將二者的溶液混合攪拌均勻，然后通過冷凍干燥成型而得到多孔的海綿狀支架[Takayuki Kondo1,Tetsuya Shinozaki1,Hiroyuki Oku,Shoji Takigami and Kenji Takagishi.Konjacglucomannan-based hydrogel with hyaluronic acid as a candidate for a novel scaffold for chondrocyte culture.J Tissue EngRegenMed.2009,3:361–367]。該制備方法是將KGM和HA的混合溶膠直接進行凍干賦形，兩種大分子均沒有發生實質的凝膠化轉變而形成穩定的網絡骨架。
除了與天然生物大分子復配，KGM也與人工合成高分子相結合以制得力學性能更穩定的雜混水凝膠。例如以KGM為原料，以N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，以丙烯酸為單體，在引發劑過硫酸鉀或硝酸鈰銨存在下引發聚合反應制備得到的KGM/N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺水凝膠或KGM/聚丙烯酸水凝膠[王雅立,魔芋葡甘聚糖/N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺水凝膠的溶脹行為研究.安徽農學通報,2015，21(14):26-46；陳立貴，王忠，付蕾，等.魔芋葡甘聚糖/聚丙烯酸水凝膠的溶脹動力學及性能影響因素.安徽農業科學，2007，35(29):9134-9135]。但這類復合水凝膠的主要不足之處在于，反應過程中引入的化學合成交聯劑、引發劑以及人工聚合高分子導致了水凝膠的生物相容性遠不及天然生物大分子材料；其生物可降解性也較大程度地降低或不易降解。
現有技術一的技術方案：分別配制2％殼聚糖溶液、1％魔芋葡甘聚糖水溶液，將兩種溶液與適宜濃度的膠原蛋白溶液按一定比例于45℃熱水浴中充分混合,減壓脫泡后倒入成膜模具中,真空干燥成膜。然后用適宜濃度的NaOH溶液處理，再用蒸餾水反復洗滌、晾干。[王碧,王坤余,但衛華,張廷有,葉勇.葡甘聚糖-膠原蛋白-殼聚糖共混膜.生物醫學工程學雜志,2006,23(1)∶102～106]
以魔芋葡甘聚糖，膠原蛋白為主要原料，以甘油為添加劑，加入1mL氨水調節pH值為10～12，在100mL蒸餾水中制得不同配比的混合液，攪拌45min、靜置15min左右，減壓脫泡后倒入成膜模具中，在60℃下干燥8～9h即可成膜。[景森，陳慶華，潘興華，張峰，董會.膠原蛋白/葡甘聚糖共混膜的制備及性能表征.中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(10):1885-1888]
分別配制相同濃度的KGM和SPI溶液，并且等體積混合，在75℃下迅速攪拌10min，待二者充分混合后分別加入膠原蛋白、甘油及單甘酯攪拌至均勻，并用碳酸氫鈉調節pH至8左右，充分攪拌，去除氣泡，45℃下干燥2h，揭膜即得復合眼貼膜基膜。[潘廷跳，張俊明，潘振華，蘇晨帆，龐杰.復含眼貼膜的研制.日用化學品科學,2012,35(3):31-35]
以現有技術一為代表的涉及以KGM和膠原為主要復配成分的制備方法都是以制備共混膜材料為目的，即制備“膜”形態的復合材料。
由于KGM在高溫高堿條件下會發生熱不可逆凝膠化反應，技術一在制備以KGM和膠原為主要成分的共混膜的過程中，通常會使用遠高于生理溫度的高溫(最低有用45℃，一般在60℃以上)和高堿的條件以實現KGM的熱不可逆凝膠化，從而進一步增強共混膜的力學性能。然而這樣的高溫高堿條件會使液態環境中的膠原分子結構發生改變，從而導致膠原大部分或全部變性而失去本身的生物活性。
膠原分子的生物活性即生物學功能表現在：能誘導細胞的增殖、分化和遷移；能于體外再次重組形成與天然膠原纖維相似的有序纖維結構；誘導纖維粘連素、氨基多糖和生長因子；有好的凝血性能；低免疫原性等等。膠原分子的這些生物活性與其分子的三螺旋結構密切相關。因此，作為生物醫學材料，保持膠原分子本身的三螺旋結構不被破壞以保留其具有的生物活性是實際應用中人們所期望達到的要求，是至關重要的。
現有技術二，步驟一，共滴定法制備納米羥基磷灰石(HAP)/膠原復合粉體：
把一定量的磷酸溶液和膠原蛋白一起加入到盛有蒸餾水的燒杯中并置于磁力攪拌器上攪拌均勻，同時按羥基磷灰石的化學計量比稱取Ca(OH)2粉末加入到盛有蒸餾水的燒杯中磁力攪勻至上清液。把飽和Ca(OH)2溶液與膠原蛋白磷酸溶液同時滴入另一磁力攪拌的燒杯中，通過控制滴速來調節pH值及反應時間，反應溫度為室溫(25℃左右)。飽和Ca(OH)2溶液滴完后加入氨水調節pH值為10.0，反應結束后繼續攪拌12h，此時pH值降為7.0左右。然后放入冷藏箱中陳化10天左右，用抽濾機抽除大部分水后置入冷藏冷凍柜中進行冷凍，然后再置于真空冷凍干燥機中干燥，最后將制得的粉末經過400目篩過篩。
步驟二，溶膠凝膠法及冷凍干燥法制備納米HAP/膠原/KGM多孔骨支架：
量取少量的氨水滴入蒸餾水中，按一定比例加入納米羥基磷灰石/膠原納米粉和KGM粉并快速攪拌，形成粘稠狀凍膠，靜置一段時間后置于70℃水浴中膠凝24h。取出凝膠塊置入盛有蒸餾水的燒杯中，再置于70℃水浴鍋中進行脫堿，直到pH值為7.0后脫堿完成。將試樣放入30℃水浴中恒溫1h后置入一定溫度的低溫冷凍箱中深冷凍24h，取出凍膠置入真空冷凍干燥機中干燥，制得復合多孔骨支架。[黃明華，陳寰貝，陳慶華，陶世剛，諶強國，顏廷亭.納米羥基磷灰石/膠原/魔芋葡甘聚糖多孔骨支架研究.人工晶體學報.2015,44(7):1961-1967]
該方法先利用共滴定法在膠原蛋白存在下合成羥基磷灰石，經過凍干后得到納米羥基磷灰石/膠原復合粉體，再將該復合粉體和KGM在堿性條件下混合均勻后再于70℃高溫下處理以得到KGM的凝膠體。與技術一相似，該制備過程仍然需要高溫堿性條件以實現KGM的凝膠固化，因而難以保持其中的重要成分膠原分子的生物活性。
技術實現要素：
針對上述技術問題，本發明提供一種膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，突破目前膠原與KGM的復配方式只局限于膜材料的現狀，實現以膠原和KGM為主要成分的蛋白-多糖醫用復合水凝膠材料的制備；在膠原與KGM的復配以及由此所得復合體系的凝膠固化過程中，實現膠原分子的生物活性得以很好保持，結構不被破壞而變性。特別在以KGM為代表的非離子型多糖大分子對膠原基復合水凝膠力學性能的改善提高的基礎上，結合天然生物交聯劑的交聯作用，實現膠原基復合水凝膠力學性能的增強。
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以4℃的pH2～5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2～20mg/mL；
以4～100℃的去離子水配制質量百分比為0.1～10％的非離子型多糖溶液；
將非離子型多糖溶液溫度保持在4～25℃，在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入非離子型多糖溶液，攪拌反應10～120min；
反應結束后，保持在4℃，將反應所得混合液低速離心、濃縮；
濃縮結束后，保持在4℃，對濃縮物調節pH值至7～11；
將濃縮物于15～37℃恒溫保持0.5～10h，制得膠原-非離子型多糖復合水凝膠；
將膠原-非離子型多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗2～8次，除去其中殘留的鹽分；
將清洗后的膠原-非離子型多糖復合水凝膠置于濃度為1～20mg/ml的生物交聯劑溶液中，于15～37℃下恒溫振搖1～72h，然后于去離子水中反復浸洗，除去未反應的生物交聯劑。
或者，膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以4℃的pH2～5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2～20mg/ml；
以4～100℃的去離子水配制質量百分比為0.1～10％的非離子型多糖溶液，將多糖溶液的pH值調節到7～11；
將非離子型多糖溶液溫度保持在4～25℃，在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入多糖溶液，攪拌反應10～120min，調節混合體系的pH值到6～10；
反應結束后，保持在4℃，將反應所得混合液低速離心、濃縮；
濃縮結束后，將濃縮物于15～37℃恒溫0.5～10h，制得膠原-非離子型多糖復合水凝膠；
將膠原-非離子型多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗2～8次以除去其中殘留的鹽分；
將膠原-非離子型多糖復合水凝膠置于濃度為1～20mg/ml的生物交聯劑溶液中，于15～37℃下恒溫振搖1～72h，然后于去離子水中反復浸洗，除去未反應的生物交聯劑。
所述的非離子型多糖為魔芋葡甘聚糖(KGM)、淀粉、普魯蘭多糖、刺槐豆膠中的至少一種。
所述的生物交聯劑為原花青素或京尼平。
本發明提供的膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，保持了較為完整的天然三螺旋結構的膠原分子具有生物活性，而具有生物活性的膠原分子在接近生理條件(溫度，pH)的溫和環境下，能夠自發地重現機體內膠原分子的1/4錯位排列聚集組裝行為，生成由膠原分子自組裝而成的納米纖維三維網絡結構，即形成膠原水凝膠。本發明依據膠原分子的這一天然屬性，在溫和條件下進行膠原與非離子型多糖的共混復合后，通過膠原分子自組裝生成膠原水凝膠網絡骨架來實現膠原-非離子型多糖共混體系的固化，從而制備得到膠原-非離子型多糖復合水凝膠。因此，本發明的技術方案實現了以下有益效果：
(1)在溫和條件下，實現了以膠原和KGM等非離子型多糖為主要成分的膠原-非離子型多糖復合水凝膠的制備。拓展了膠原-非離子型多糖復合體系只局限于膜材料的研究和應用。
(2)由于膠原-非離子型多糖復合水凝膠的制備條件均為溫和條件，避免了高溫環境，復合水凝膠中的膠原分子的生物活性得到很好保護，保持了膠原-非離子型多糖復合水凝膠作為生物醫學材料的優勢。
(3)由于KGM等非離子型多糖分子與膠原分子有良好的相容性，并且非離子型多糖的平均分子量遠遠大于膠原分子量，在膠原分子自組裝成纖維網絡的過程中，穿插纏繞于膠原分子之間的屈曲態的非離子型多糖分子也會被結合在所生成的膠原纖維中，進而絞結在三維的纖維網絡之中，形成有效的物理交聯效應，因而相對于純膠原水凝膠較差的力學性能，非離子型多糖與膠原相復配就有效地提高了復合水凝膠的機械力學性能。
(4)在以KGM為代表的非離子型多糖大分子對膠原基全天然復合水凝膠力學性能改善提高的基礎上，結合天然生物交聯劑的交聯作用，進一步增強膠原基全天然復合水凝膠的力學性能。
具體實施方式
結合實施例說明本發明的具體實施方式。
實施例1
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為6mg/mL。以溫度為10℃的去離子水配制質量百分比為0.6％的KGM溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應20min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至11。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于37℃恒溫4h制得膠原-KGM復合水凝膠。將膠原-KGM復合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-KGM復合水凝膠置于濃度為5mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖48h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的原花青素小分子。
實施例2
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為3mg/mL。以溫度為4℃的去離子水配制質量百分比為0.8％的KGM溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應40min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至10。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于32℃恒溫2h制得膠原-KGM復合水凝膠。將膠原-KGM復合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-KGM復合水凝膠置于濃度為1mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖72h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的京尼平分子。
實施例3
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為5mg/mL。以溫度為4℃的去離子水配制質量百分比為1％的KGM溶液，將KGM溶液的pH值調節到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應120min，調節混合體系的pH值到7.5。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于15℃恒溫10h制得膠原-KGM復合水凝膠。將膠原-KGM復合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復合水凝膠置于濃度為15mg/ml的原花青素溶液中，于30℃下恒溫振搖5h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的原花青素小分子。
實施例4
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2mg/mL。以溫度為15℃的去離子水配制質量百分比為1.5％的KGM溶液，將KGM溶液的pH值調節到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應60min，調節混合體系的pH值到9。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于35℃恒溫0.5h制得膠原-KGM復合水凝膠。將膠原-KGM復合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復合水凝膠置于濃度為20mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖1h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的京尼平分子。
實施例5
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為18mg/mL。以溫度為90℃的去離子水配制質量百分比為0.1％的淀粉溶液，待溶液溫度降至15℃，調節其pH值至9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應90min，調節混合體系的pH值到8。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于37℃恒溫2h制得膠原-淀粉復合水凝膠。將膠原-淀粉復合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復合水凝膠置于濃度為8mg/ml的原花青素溶液中，于35℃下恒溫振搖12h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的原花青素小分子。
實施例6
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為10mg/mL。以溫度為100℃的去離子水配制質量百分比為8％的淀粉溶液，待溶液溫度降至20℃，調節其pH值至11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應120min，調節混合體系的pH值到7。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于30℃恒溫5h制得膠原-淀粉復合水凝膠。將膠原-淀粉復合水凝膠置于去離子水中浸洗2次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復合水凝膠置于濃度為1mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖36h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的京尼平分子。
實施例7
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為15mg/mL。以溫度為95℃的去離子水配制質量百分比為2％的淀粉溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應100min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至9。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于18℃恒溫2h制得膠原-淀粉復合水凝膠。將膠原-淀粉復合水凝膠置于去離子水中浸洗5次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復合水凝膠置于濃度為10mg/ml的原花青素溶液中，于20℃下恒溫振搖48h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的原花青素分子。
實施例8
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為12mg/mL。以溫度為80℃的去離子水配制質量百分比為5％的淀粉溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應120min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至10。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于23℃恒溫3h制得膠原-淀粉復合水凝膠。將膠原-淀粉復合水凝膠置于去離子水中浸洗8次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復合水凝膠置于濃度為15mg/ml的京尼平溶液中，于37℃下恒溫振搖1h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的京尼平分子。
實施例9
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為20mg/mL。以溫度為10℃的去離子水配制質量百分比為3％的普魯蘭多糖溶液，將溶液的pH值調節到9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應40min，調節混合體系的pH值到7.5。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于37℃恒溫6h制得膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于濃度為20mg/ml的原花青素溶液中，于20℃下恒溫振搖30h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的原花青素小分子。
實施例10
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為7mg/mL。以溫度為15℃的去離子水配制質量百分比為10％的普魯蘭多糖溶液，將溶液的pH值調節到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應20min，調節混合體系的pH值到8。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于15℃恒溫5h制得膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于濃度為10mg/ml的京尼平溶液中，于28℃下恒溫振搖16h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的京尼平分子。
實施例11
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為4mg/mL。以溫度為40℃的去離子水配制質量百分比為7％的普魯蘭多糖溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應80min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至9。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于32℃恒溫0.5h制得膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于濃度為5mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖8h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的原花青素分子。
實施例12
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為12mg/mL。以溫度為30℃的去離子水配制質量百分比為0.5％的普魯蘭多糖溶液，將溶液溫度降至4℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應100min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至7。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于35℃恒溫3h制得膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-普魯蘭多糖復合水凝膠置于濃度為8mg/ml的京尼平溶液中，于30℃下恒溫振搖20h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的京尼平分子。
實施例13
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為18mg/mL。以溫度為85℃的去離子水配制質量百分比為0.1％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至4℃，將其pH值調節到9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應50min，調節混合體系的pH值到7.0。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于37℃恒溫2h制得膠原-刺槐豆膠復合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于濃度為10mg/ml的原花青素溶液中，于25℃下恒溫振搖12h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的原花青素小分子。
實施例14
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為11mg/mL。以溫度為75℃的去離子水配制質量百分比為1％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至15℃，將其pH值調節到10。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應70min，調節混合體系的pH值到7.5。將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結束后，將濃縮物于30℃恒溫5h制得膠原-刺槐豆膠復合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于去離子水中浸洗2次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于濃度為5mg/ml的京尼平溶液中，于30℃下恒溫振搖40h，然后于去離子水中反復浸洗以去除未反應的京尼平分子。
實施例15
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為7mg/mL。以溫度為80℃的去離子水配制質量百分比為3％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應90min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至8。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于25℃恒溫5h制得膠原-刺槐豆膠復合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于濃度為1mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖60h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的原花青素分子。
實施例16
膠原基復配非離子型多糖構建復合水凝膠的制備方法，包括以下過程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為3mg/mL。以溫度為95℃的去離子水配制質量百分比為5％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至25℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應110min，將反應所得混合液低速離心后進行濃縮。濃縮結束后，對濃縮物調節pH值至6.5。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于35℃恒溫8h制得膠原-刺槐豆膠復合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于去離子水中浸洗8次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-刺槐豆膠復合水凝膠置于濃度為15mg/ml的京尼平溶液中，于18℃下恒溫振搖30h，然后于去離子水中反復浸洗以除去未反應的京尼平分子。