本發明涉及煙用添加劑領域，具體涉及利用固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的制備方法。
背景技術：
加香加料是卷煙工藝中的關鍵環節，是完善產品風格的決定因素和提高卷煙香氣質量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對天然動植物的提取、化學合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學合成條件較苛刻限制。隨著生物技術的發展，近年來，利用微生物發酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產提供一條經濟、高效的途徑，開發一些傳統方法無法生產的新型煙用香原料。
微生物固定化技術，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應條件下能夠快速、大量增殖的生物技術，能夠彌補懸浮微生物發酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點。因此，近年來，微生物固定化技術的研究非常活躍，發展較快，已應用到許多工業部門如食品發酵工業，環境保護，新能源開發以及生物傳感器等，并取得了深入發展，顯示出了強大的優越性。主要涉及到以下幾個方面：在食品發酵工業中用于生產乙醇、啤酒、酸奶等；在環境保護中用于環境監測和工業廢水的處理；在新能源開發中用于生產氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡單化、安全自動化、無污染等方向發展，在能源危機、資源短缺、環境污染日趨嚴重的情況下，由此將推動其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應用，具有更加深遠的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應用前景。但在利用微生物固定化技術制備煙用月桂提取物卻未見報道。
月桂(學名：laurusnobilis)，樟科月桂屬小喬木或灌木植物。月桂原產于地中海一帶，中國浙江、江蘇、福建、四川、云南等地有引種栽培。以月桂為原料的月桂浸膏、月桂提取物、月桂精油等在卷煙中應用廣泛，具有豐富煙香、增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣的作用。
醋酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量醋酸等有機酸細菌的通稱，醋酸菌廣泛應用于食醋、果醋等釀造行業中，但在煙用天然香料的制備中卻很少報道。醋酸菌在發酵過程中產生大量有機酸，這些有機酸在卷煙中具有降低刺激性和柔和細膩煙氣的作用，同時，還能賦予卷煙特征的酸香風格，因此，醋酸菌發酵在提升煙用天然香料的品質方面具有良好的應用前景。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，采用固定化醋酸菌發酵技術，開發了一種新型的月桂提取物，該提取物可以在卷煙中使用，能夠豐富煙香，提升卷煙香氣質量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。
本發明提供一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：
(1)取月桂根葉，加入其重量2～5倍的水，浸泡12～24h，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取時間為2～3小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到月桂提取物a；
(2)將醋酸菌接種到肉湯培養基中，在溫度37℃、攪拌轉速為50rpm的條件下培養48小時，取培養液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總溶液體積的2～5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與步驟(3)中制備的固定化醋酸菌小球按照質量比5～10:1混合，在溫度為30～37℃，攪拌轉速為1～5rpm的條件下發酵3～7d，然后置于4℃冷柜中保存7～14d；
(5)取步驟(4)中冷藏后的發酵液，加入其質量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.25～1.30，得月桂提取物b；
(6)將步驟(5)的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進料溫度為50℃～65℃，進料速度為5～50ml/min，刮板轉速為120～180rpm的條件下進行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質量的百分比為10％～30％。
本發明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016436。
本發明采用的微生物固定化技術具有發酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強等優點，能夠彌補傳統生物工藝的不足。
本發明以月桂根為原料，利用固定化醋酸菌發酵月桂提取物，獲得了一種品質優良的煙用月桂提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質量，增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性等作用，同時還賦予卷煙特色的酸香風格；與懸浮醋酸菌發酵相比，該方法制備的月桂提取物有機酸含量增加了2.15％～5.68％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。該方法替代了月桂提取物傳統的提取技術，更新了生物發酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對煙用月桂提取物的制備提供了一條新途徑。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進一步詳細的描述。
本發明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016436。
本發明以下實施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化醋酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對醋酸菌進行固定化得到的：
(1)將醋酸菌接種到肉湯培養基中，在溫度37℃、攪拌轉速為50rpm的條件下培養48小時，取培養液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中肉湯培養基為常用的普通肉湯培養基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；
(2)醋酸菌的聚乙烯醇—海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質量百分比6％-10％的聚乙烯醇和質量百分比1％-3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總溶液體積的2-5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經過1-5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質量百分比為1-3％的硼酸飽和溶液中，交聯1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和飽和na2so4溶液的量并無特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產生沉淀，滿足醋酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液和飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。
實施例1，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：
(1)將月桂葉粉碎，加入其重量5倍的水浸泡12小時，然后在100℃下回流提取2次，每次提取時間為3小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并兩次提取液，得到月桂提取物a，兩次提取的條件完全相同；
(2)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質量比5:1混合，在溫度為30℃，攪拌轉速為5rpm的條件下發酵4d，然后置于4℃冷柜中保存7d；
(3)將步驟(2)發酵冷藏靜置后發酵液過濾，得澄清發酵液，加入其質量3倍的95％酒精溶液，沉淀24小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.25，得月桂提取物b；
(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進料溫度為50℃～65℃，進料速度為5～50ml/min，刮板轉速為120～180rpm的條件下進行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質量的百分比為20％。
實施例1中制備的月桂提取物在卷煙中具有豐富煙香，提升卷煙香氣質量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。
實施例2，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：
(1)將月桂葉粉碎，加入其重量3倍的水浸泡24小時，在98℃下回流提取3次，每次提取時間為2小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取的條件完全相同；
(2)將步驟(1)中制備的月桂提取物a與制備的固定上述方法中制備的化醋酸菌小球按照質量比8:1混合，在溫度為35℃，攪拌轉速為3rpm的條件下發酵5d，，然后置于4℃冷柜中保存10d；
(3)將步驟(3)發酵后發酵液過濾，得澄清發酵液，加入其質量4倍的80％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.30，得月桂提取物b；
(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進料溫度為50℃～65℃，進料速度為5～50ml/min，刮板轉速為120～180rpm的條件下進行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質量的百分比為30％。
實施例2中制備的月桂提取物具有豐富煙香，提升卷煙香氣質量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。
實施例3，一種固定化醋酸菌制備煙用月桂提取物的方法，包括以下步驟：
(1)將月桂葉粉碎，加入其重量2倍的水浸泡20小時，在95℃下回流提取3次，每次提取時間為3小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到月桂提取物a；三次提取條件完全相同；
(2)將步驟(1)中的月桂提取物a與上述方法制備的固定化醋酸菌小球按照質量比10:1混合，在溫度為36℃，攪拌轉速為4rpm的條件下發酵7，，然后置于4℃冷柜中保存14d；
(3)將步驟(2)發酵后發酵液過濾，得澄清發酵液，加入其質量2倍的95％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.15，得月桂提取物b；
(4)取步驟(3)中制備的月桂提取物b，加入丙二醇，在壓力0.1～10pa，進料溫度為50℃～65℃，進料速度為5～50ml/min，刮板轉速為120～180rpm的條件下進行分子蒸餾，取輕組分為月桂提取物；其中丙二醇的加入量占分子蒸餾物總質量的百分比為40％。
實施例3中制備的月桂提取物具有豐富煙香，提升卷煙香氣質量，增加酸香香韻，增加卷煙香氣透發性，柔和細膩煙氣，降低刺激性，掩蓋雜氣，改善余味，改善喉部舒適性。
對比實驗，申請人將本發明制備的月桂提取物與現有傳統提取方法制備的月桂提取物、采用懸浮醋酸菌發酵制備的月桂提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進行評吸，其評吸效果如下：
三種不同工藝制備的月桂提取在卷煙中的感官評價效果比較
從上述對比實驗可以看出來，本發明中制備的月桂提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據具體實驗分析發現，與懸浮醋酸菌發酵相比，該方法制備的月桂提取物有機酸含量增加了2.15％～5.68％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。