一種經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA的方法與流程

本發明屬于釀酒技術領域，具體涉及白酒生產企業中的一種經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA的方法。

背景技術：

酒醅中微生物基因組DNA提取是研究白酒釀造過程中微生物組成、微生物功能、微生物代謝和微生物與環境關系的必須條件。因此，酒醅基因組DNA的提取速度、提取質量在白酒生產及研究中起著重要作用。

目前，對酒醅中微生物基因組DNA提取的方法可分為手提和試劑盒法。手提法采用液氮研磨破壁或者酶解破壁、苯酚：氯仿：異戊醇(P.C.I)純化、異丙醇或乙醇沉淀DNA、水溶解DNA。該方法雖然成本低，但耗時較長、勞動強度大、提取的DNA質量不高。試劑盒法采用配置好的試劑，只需按流程操作即可。該方法雖然操作簡單，但是由于酒醅中微生物數量較少，50mL規格試劑盒吸附柱損失較大，提取出來的DAN濃度很低，2mL規格試劑盒耗時較長、勞動強度大；且同樣存在濃度低的問題，需要將多個重復的樣本的DNA合并，導致成本昂貴，不適合企業的常規檢測。

因此，本領域需要一種經濟快速提取酒醅中基因組DNA的方法。

技術實現要素：

為了解決現有技術中酒醅基因組DNA提取存在的問題，在白酒生產研發中，為了經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA，本發明提供了一種經濟快速高質量提取酒醅中微生物基因組DNA的方法。該方法結合手提和試劑盒方法，對現有方法改進優化，綜合考慮提取成本、操作簡便性、勞動力和提取質量等。通過比較驗證，開發一種經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA的方法。該方法操作簡便、耗費成本低、勞動強度小、節約時間、提取的酒醅中微生物基因組質量高。

具體通過以下技術方案實現：

一種經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA的方法，包括以下步驟：

1)酒醅中微生物細胞破壁：將研磨劑、酒醅樣品和裂解液三者混合，高速震蕩，然后離心；

所述的研磨劑為玻璃珠、石英砂、氧化鋁；優選地，為石英砂；更優選地，為12-20目的石英砂；更優選地，為16目的石英砂。

2)核酸純化。

在本發明優選的實施例中，所選擇的研磨劑石英砂。石英砂堅硬度高、有棱角，玻璃珠表面平滑，在相同時間內石英砂破碎效果好于玻璃珠；其次，酒醅樣品DNA提取所需研磨劑較多，石英砂成本低于玻璃珠。研磨劑的種類和粒徑有多種，在本發明公開的多種粒徑的玻璃珠和石英砂研磨劑中，采取12-20目的石英砂作為研磨劑，能夠提取出高濃度的基因組DNA。

其中，步驟1)中，

研磨劑、酒醅樣品和裂解液的三者的比例為15～22g:6～9g:16～24mL；優選地，為18.5g:7.5g:20mL；

裂解液配方如下：1.5-2.5％CTAB(w/v)，90-112mM Tris-HCl(pH 8.0)，18-24mM EDTA(pH8.0)，1.2-1.6M NaCl；優選2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl；

離心轉數為10000rpm，離心時間為10min。

步驟2)中，核酸的純化具體包含以下步驟：

a)除雜：取步驟1)中的離心后的上清液加入P.C.I，混勻，離心；

所述的P.C.I為24-26體積苯酚：23-25體積氯仿：0.5-1.5體積異戊醇；優選25體積苯酚：24體積氯仿：1體積異戊醇；

P.C.I與上清液的體積比為1:0.8～1.2；

離心轉數為10000rpm，離心時間為20min。

b)吸附：取步驟是a)中的上清液與硅膠膜結合液混勻，然后過核酸純化柱，離心棄濾液；所述的硅膠膜結合液為pH為4-6.5的鹽酸胍與乙酸鉀的混合液。

在本發明優選的實施例中，所述的硅膠膜結合液為pH為5的鹽酸胍與乙酸鉀的混合液。

在本發明優選的實施例中，選取的核酸純化柱為15mL的核酸純化柱；更優選地，所述的核酸純化柱含有8層或以上的硅膠膜。當硅膠膜的層數達到一定數量時，DNA能夠穩定地附著在硅膠膜上，在后面洗柱的步驟中不易脫落下來。所述的核酸純化柱可以選擇市售的核酸純化柱。

上清液與硅膠膜結合液的體積比為1:1.5～2.5；

硅膠膜結合液為：3-4M鹽酸胍：0.5M乙酸鉀；優選4M鹽酸胍：0.5M乙酸鉀。

c)洗柱：加入2.5-3.5mL 70％乙醇過核酸純化柱，然后高速離心甩干核酸純化柱，自然條件下干燥；

洗柱的次數為兩次；

自然干燥的時間為30～60min；優選地，為40min。

d)洗脫：在核酸提取柱的硅膠膜上加洗脫液溶解DNA，離心洗脫下DNA溶液。

所述的洗脫液選自無菌水或TE溶液；

洗脫液的體積為50～300μL；

離心轉數為10000rpm，離心時間為2min。

一種經濟快速提取酒醅中微生物基因組DNA的方法，其特征在于更具體的步驟如下：

將12～20目的石英砂滅菌烘干后，稱取15～22g裝入50mL無菌離心管中；

稱取6～9g酒醅樣品于離心管，加入16～24mL裂解液，均質儀震蕩1min，10000rpm離心10min；

轉移上清至50mL無菌離心管中，加0.8～1.2mL的P:C:I，搖勻，11000rpm離心20min；所述的P.C.I為25體積苯酚：24體積氯仿：1體積異戊醇。

轉移上清至50mL無菌離心管中，加1.5～2.5mL的硅膠膜結合液，搖勻；用15mL核酸純化柱過濾，棄濾液；硅膠膜結合液為pH為5的鹽酸胍和乙酸鉀的混合液。

吸附柱中加2.5～3.5mL 70％乙醇，過濾，棄濾液，重復一次。

10000rpm空管離心2min，棄濾液；

純化柱自然條件下干燥1h，加入50～300μL無菌去離子水或TE溶液溶解DNA，過濾，濾液裝于1.5mL無菌離心管中，-20℃保存備用。

所述的裂解液配方如下：2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(PH8.0)，1.4M NaCl。

所述的硅膠膜結合液配方如下：4M鹽酸胍：0.5M乙酸鉀。

所述步驟15mL核酸純化柱含有8層硅膠膜。

發明人發現，特定的研磨劑的選擇可以在很大程度上影響將純化柱純化方法應用于酒醅微生物DNA提取的提取效果。在多種研磨劑量中，一定目數的石英砂呈現出突出的適應性優勢。

與現有技術相比，本發明取得的有益效果如下：

1.快速：液氮研磨破壁需30min，而且耗費體力；酶解破壁至少需2h；本方法只需高速震蕩1min，即可使細胞破碎，釋放核酸。整個DNA提取的時間為2～2.5h，而液氮研磨需4～4.5h，酶解破壁需4.5～5h。

2.成本低：試劑盒法提取一個樣品需300元左右成本，而本方法可以將成本控制在50元以內，該方法操作簡便、耗費成本低、勞動強度小。

3.DNA質量高：手提法中采用乙醇或異丙醇沉淀核酸方法，核酸所含雜質較多，一般需加入純化步驟；本方法采用硅膠膜吸附DNA，無需純化，提取基因組DNA質量高。本方法提取的基因組DNA質量與試劑盒法相當。

4.本發明采用特定目數的石英砂作為破壁的研磨劑，在酒醅微生物的DNA提取中取到非顯而易見的效果。現有技術中酒醅DNA提取的破壁為液氮或酶解法，上述兩種方法費時費力；或者采用了DNA提取試劑盒中玻璃珠作為研磨劑，然而，玻璃珠作為本發明的研磨劑時，由于表面平滑，在相同時間內破壁效果比石英砂差；其次，本實驗所需研磨劑較多，石英砂的成本遠低于玻璃珠。

綜上，本發明采用手提法和試劑盒結合的方法，在節省時間和成本的前提小，可以保證DNA提取的質量和濃度基本上達到采用試劑盒法，有利于白酒生產企業中大規模地應用此酒醅微生物DNA提取的方法。

附圖說明

圖1為本發明提取酒醅中微生物基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳成相圖。

圖2為本發明提取酒醅中微生物基因組DNA的濃度測定。

圖3為不同的研磨劑破壁效果比對瓊脂糖凝膠電泳成相圖。

圖4為對比例1提取酒醅中微生物基因組DNA的濃度測定。

圖5為對比例2提取酒醅中微生物基因組DNA的濃度測定。

具體實施方式

以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發明保護范圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬于本發明的保護范圍。

下列實施例中的操作步驟以在50mL離心管操作為例。如需其他規模提取，按比例縮小或放大試劑與樣品量即可。

兩種試劑的配置

1.裂解液

裂解液組分(CTAB)

2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.4M NaCl。

裂解液制備方法

配置Tris-HCl，pH調為8.0，滅菌；配置EDTA，pH調為8.0，

滅菌；四種組分混合后，滅菌。

2.硅膠膜結合液

(1)硅膠膜結合液組分

4M鹽酸胍，0.5M乙酸鉀(pH 5.0)。

(2)硅膠膜結合液制備方法

兩種組分混合后，用濃鹽酸將pH調至5.0，滅菌。

實施例1酒醅中微生物基因組DNA提取

1.將16目的石英砂滅菌烘干后，稱取18.5g裝入50mL無菌離心管中。

2.稱取7.5g酒醅樣品于離心管，加入20mLCTAB提取液，均質儀震蕩1min，10000rpm離心10min。。

3.轉移上清至50mL無菌離心管中，加0.8～1.2倍體積P:C:I(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，搖勻，11000rpm離心20min。

4.轉移上清至50mL無菌離心管中，加1.5～2.5倍體積硅膠膜結合液，搖勻；用15mL吸附柱過濾，棄濾液，濾完為止。

5.吸附柱中加3mL 70％乙醇，過濾，棄濾液。

6.重復步驟5一次。

7.10000rpm空管離心2min，棄濾液。

8.吸附柱自然條件下干燥1h，加入300μL無菌水溶解DNA，過濾，濾液裝于1.5mL無菌離心管中，-20℃保存備用。

實施例2酒醅中微生物基因組DNA提取

1.將12目的石英砂滅菌烘干后，稱取15g裝入50mL無菌離心管中。

2.稱取6g酒醅樣品于離心管，加入16mLCTAB提取液，均質儀震蕩1min，10000rpm離心10min。。

3.轉移上清至50mL無菌離心管中，加等體積P:C:I(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，搖勻，11000rpm離心20min。

4.轉移上清至50mL無菌離心管中，加2倍體積硅膠膜結合液，搖勻；用15mL吸附柱過濾，棄濾液，濾完為止。

5.吸附柱中加2.5mL 70％乙醇，過濾，棄濾液。

6.重復步驟5一次。

7.10000rpm空管離心2min，棄濾液。

8.吸附柱自然條件下干燥1h，加入50μL無菌水溶解DNA，過濾，濾液裝于1.5mL無菌離心管中，-20℃保存備用。

實施例3酒醅中微生物基因組DNA提取

1.將20目的石英砂滅菌烘干后，稱取22g裝入50mL無菌離心管中。

2.稱取9g酒醅樣品于離心管，加入24mLCTAB提取液，均質儀震蕩1min，10000rpm離心10min。。

3.轉移上清至50mL無菌離心管中，加等體積P:C:I(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，搖勻，11000rpm離心20min。

4.轉移上清至50mL無菌離心管中，加2倍體積硅膠膜結合液，搖勻；用15mL吸附柱過濾，棄濾液，濾完為止。

5.吸附柱中加3.5mL 70％乙醇，過濾，棄濾液。

6.重復步驟5一次。

7.10000rpm空管離心2min，棄濾液。

8.吸附柱自然條件下干燥40min，加入300μL無菌水溶解DNA，過濾，濾液裝于1.5mL無菌離心管中，-20℃保存備用。

對比例1手提法提取酒醅樣品中的DNA

提取方法參考文獻(李德林,敖宗華,鄧波,等.酒醅微生物總DNA提取方法研究[J].釀酒科技,2014,1:013.),具體如下：取7.5g酒醅于研缽中，加入液氮充分研磨，轉入離心管加入15mL CTAB抽提液(2％CTAB、5moL/L NaCl、1moL/L Tris-HCl(pH8)、0.5moL/L EDTA)和300μL巰基乙醇，65℃恒溫混勻儀振蕩30min，加入75μL蛋白酶k(20mg/mL)，55℃恒溫混勻儀振蕩30min室溫以5000r/min離心10min，收集上清液。加入等體積酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，以12000r/min離心10min，取上清液加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)12000r/min離心5min，取上清液，重復2次，加入0.6體積預冷的異丙醇后于-20℃下沉淀1h后以12000r/min離心10min，小心倒掉液體。沉淀用70％voL乙醇洗滌數次，提取得到DNA吹干后加入TE溶解，-20℃保存。

對比例2試劑盒法提取酒醅樣品中的DNA

提取方法參 Soil DNA IsoLation kit試劑盒說明書。具體步驟如下：

1、往 Bead Tube中加入15mL PowerBead Solution。此組合命名為 Bead Solution Tubes。

2、加入不多于10g樣品到 Bead Solution Tubes中。快速渦旋振蕩1min混勻。

3、檢測C1溶液。若出現沉淀，60℃水浴至全溶解。加1.2mL C1溶液到Bead Solution Tubes中，快速渦旋30s混勻。

4、把 Bead Tubes固定在渦旋儀適配器上，最大轉速渦旋連續振蕩10min。

5、室溫2500g離心3min。

6、轉移上清至一個干凈的Collection Tube中。

7、加入5mL C2溶液到上清中，渦旋混勻5s。4℃孵育10min。

8、室溫2500g離心4min。

9、避開沉淀小珠，轉移上清到一個新的收集管中

10、加入4mL C3溶液到上清中，渦旋混勻5s。4℃孵育10min。

11、室溫2500g離心4min

12、避開沉淀小珠，轉移上清到一個新的收集管中。

13、C4溶液使用前先搖勻。加入30mL C4溶液到上清中，渦旋混勻5s。

14、把從13步獲得的上清加滿Spin Filter，室溫2500g離心2min。棄去濾液，再次加滿上清，室溫2500g離心3min。重復直到過濾完所有上清。

15、加入10mL C5到Spin Filter中，室溫2500g離心3min。棄去濾液。

16、室溫2500g離心5min.

17、小心轉移Spin Filter到2mL收集管中，盡量避免C5溶液污染。

18、加入5mL C6溶液到白色濾膜中心。室溫2500g離心3min.

19、棄去Spin Filter。此時收集管中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步純化。

實施例1、對比例1、對比例2的提取效果比對見表1。關于提取時間：與手提法相比，本發明的提取時間縮短了近1半，以傳統的試劑盒相比，時間也縮短了0.5-1h；關于提取成本：與傳統試劑盒比較，本發明的提取成本降低了6倍；關于提取濃度：本發明的濃度約為手提法的兩倍左右，與試劑盒法的濃度相當；關于純度：OD260是核酸吸收的最高峰，OD280是蛋白吸收的最高峰，OD230是有機試劑和多糖的吸收峰，當OD260/280處于1.8-2.0時，核酸的純度較高，純凈的核酸OD260/230應該大于等于2.0，本發明與試劑盒法均能獲得較純凈的DNA，而手提法OD260/280小于1.8，表明易受到蛋白的污染，OD260/230小于2.0，表示該提取方法難以去除碳水化合物、多肽、苯酚等。綜上，本發明在保持高濃度和純度的前提下，顯著的降低了酒醅樣品DNA提取的成本和時間，十分有利于企業大規模地提取酒醅樣品的基因組DNA。

表1實施例1、對比例1、對比例2的提取效果比對

實施例4不同的研磨劑效果比較

1.分別將5、12、16、20和25目的石英砂，以及12目、16目、20目玻璃珠滅菌烘干后，稱取18.5g裝入50mL無菌離心管中。

2.稱取7.5g酒醅樣品于離心管，加入20mLCTAB提取液，均質儀震蕩1min，10000rpm離心10min。

3.轉移上清至50mL無菌離心管中，加等體積P:C:I(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，搖勻，11000rpm離心20min。

4.轉移上清至50mL無菌離心管中，加2倍體積硅膠膜結合液，搖勻；用15mL吸附柱過濾，棄濾液，濾完為止。

5.吸附柱中加3.5mL 70％乙醇，過濾，棄濾液。

6.重復步驟5一次。

7.10000rpm空管離心2min，棄濾液。

8.吸附柱自然條件下干燥40min，加入300μL無菌水溶解DNA，過濾，濾液裝于1.5mL無菌離心管中，-20℃保存備用。

提取效果比對見表2。石英砂雖然堅硬度高，有棱有角，而且，已經有人公開了用石英砂提取酒醅樣品中的DNA，可以取到很好的破壁效果。然而，并不是所有粒徑的石英砂均能與本發明后續的提取步驟相配合，提取到質優量高的基因組DNA。經本發明證實，在較小的粒徑(5目)和較大的粒徑(25目)，其破壁效果遠遠低于玻璃珠，只有在特定范圍內的粒徑(12-16目)時，才能發揮其破壁效果，獲得高濃度(見表2)高質量(見表1)的基因組DNA。

表2不同粒徑的研磨劑的提取效果比對