本發明涉及生物技術領域，尤其涉及植物生物技術領域，具體涉及利用組織培養法生產蘋果花青苷的方法。
技術背景
花青苷是廣泛存在于植物的花、果實中的天然水溶性色素，它屬于類黃酮類化合物，是一種抗氧化劑。花青苷的有益作用有：軟化血管、降血壓、促進新陳代謝和預防心腦血管疾病，抗氧化活性、防止癌變、提高視覺功能等，是一種公認對健康有益的健康物質，而紅肉蘋果中含有豐富的花青苷。但是，目前我國在生產上推廣的紅肉蘋果品種和栽培的面積都比較少，且受時間及原材料缺乏的限制，不能滿足工廠化生產的要求，且花青苷含量較低，因此，探索一種規模化生產花青苷的方法，對功能性果品的選育以及天然抗氧化劑的開發應用具有重要意義。
本發明采用的原材料為新疆紅肉蘋果紅勛1號與富士蘋果雜交后獲得的果肉鮮紅的優系(2010-15)的新稍莖尖，其中母本新疆紅肉蘋果紅勛1號的相關特性描述，發明人已經發表了文章：Morphological characteristic and pollination compatibility ofa new red flesh apple,HongxunNo.1.Research on Crops,2013,14(1):199-204，該紅肉優系(2010-15)栽植在青島農業大學的育種基地。
技術實現要素：
本發明的目的在于利用一種新的方法提取花青苷，解決目前紅肉蘋果品種及栽培受面積少、且受季節及原材料缺乏的限制、花青苷含量過低、不能滿足工廠化生產的要求的問題。
為解決上述技術問題，本發明提供如下解決方案：
一種紅肉蘋果組培苗生產花青苷的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)獲取無菌材料：
選擇新疆紅肉蘋果與富士蘋果雜交后獲得的果肉鮮紅的優系(2010-15)紅肉蘋果的新稍莖尖為外植體，用1％吐溫(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自來水沖洗20min后，于超凈工作臺上，用75％的酒精浸泡消毒30s，無菌水沖洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期間不斷晃動，使外植體各面均接觸到消毒液，最后用無菌水清洗5遍；
(2)初代培養獲得紅肉蘋果組培苗：
將外植體接種到誘導培養基上，所述誘導培養基以MS為基本培養基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1瓊脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培養基pH值為5.8，經121℃高壓蒸汽滅菌25min后，分裝，待外植體生長成0.6-1.3cm的小芽時，進行繼代增值培養；
(3)繼代培養獲得大量紅肉蘋果組培苗：
將小芽接種到繼代培養基上進行增值培養，所述繼代培養基成分為MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，約10-20天后，分化出2-3個叢生芽，25-35天后，叢生芽長至約2cm，平均4-5周繼代一次，繼代培養過程中溫度控制在20-30℃；
(4)壯苗培養：
取繼代培養長勢良好的紅肉蘋果組培苗，接種至以MS為基本培養基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1瓊脂的培養基上，放置在17℃恒溫光照培養箱里進行壯苗培養；
(5)花青苷的提取和粗品的制備：
選取果糖或山梨醇處理的17℃恒溫培養14天后的組培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，將得到的粉末置于錐形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，將錐形瓶用封口膜封口，置于超聲波清洗器中，控制溫度在30℃，超聲30min后置于黑暗中浸提10小時，得浸提液，將浸提液用連接真空抽氣泵的布氏漏斗抽濾，將所得濾液倒入旋蒸瓶，在旋轉蒸發儀上以20-30℃的溫度旋蒸去除丙酮溶劑，然后避光靜置，再經過抽濾，濾紙上的顆粒即為花青苷粗品。
本發明所達到的有益效果是：
(1)進行初代培養時，在MS培養基中附加活性炭和PVP，防止了褐化的發生，附加100mg·L-1的羧芐青霉素，可避免細菌性污染，使外植體污染率及褐化率為0，莖尖萌動率為100％；
(2)接種到繼代培養基后，約10-20天后，分化出2-3個叢生芽，25-35天后，叢生芽長至約2cm，平均4-5周可繼代一次，使栽培面積增多，解決原材料受限制的問題；
(3)經過果糖或山梨醇處理的組培苗在17℃恒溫光照培養箱下培養14d后，其花青苷含量分別359.86U·g-1FW和349.41U·g-1FW，是室溫下(25℃)常規蔗糖培養基上的花青苷含量(45.86U·g-1FW)的7.8和7.6倍，其中果糖處理的17℃條件下培養14d后組培苗花青苷含量分別是5年生結果樹花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新葉(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍，花青苷含量大大提高。
附圖說明
圖1為紅肉蘋果優系(2010-15)5年生樹不同時期不同器官的花青苷含量。
具體實施方式
實施例：
一種紅肉蘋果組培苗生產花青苷的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)獲取無菌材料：
選擇新疆紅肉蘋果與富士蘋果雜交后獲得的果肉鮮紅的優系(2010-15)紅肉蘋果的新稍莖尖為外植體，用1％吐溫(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自來水沖洗20min后，于超凈工作臺上，用75％的酒精浸泡消毒30s，無菌水沖洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期間不斷晃動，使外植體各面均接觸到消毒液，最后用無菌水清洗5遍；
(2)初代培養獲得紅肉蘋果組培苗：
將外植體接種到誘導培養基上，所述誘導培養基以MS為基本培養基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1瓊脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培養基pH值為5.8，經121℃高壓蒸汽滅菌25min后，分裝，待外植體生長成0.6-1.3cm的小芽時，進行繼代增值培養；
(3)繼代培養獲得大量紅肉蘋果組培苗：·
將小芽接種到繼代培養基上進行增值培養，所述繼代培養基成分為MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，約10-20天后，分化出2-3個叢生芽，25-35天后，叢生芽長至約2cm，平均4-5周繼代一次，繼代培養過程中溫度控制在20-30℃；
(4)壯苗培養：
取繼代培養長勢良好的紅肉蘋果組培苗，接種至以MS為基本培養基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1瓊脂的培養基上，放置在17℃恒溫光照培養箱里進行壯苗培養；
(5)花青苷的提取和粗品的制備：
選取果糖或山梨醇處理的17℃恒溫培養14天后的組培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，將得到的粉末置于錐形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，將錐形瓶用封口膜封口，置于超聲波清洗器中，控制溫度在30℃，超聲30min后置于黑暗中浸提10小時，得浸提液，將浸提液用連接真空抽氣泵的布氏漏斗抽濾，將所得濾液倒入旋蒸瓶，在旋轉蒸發儀上以20-30℃的溫度旋蒸去除丙酮溶劑，然后避光靜置，再經過抽濾，濾紙上的顆粒即為花青苷粗品。
上述花青苷的提取和粗品的制備中選擇的丙酮溶劑易揮發，可以通過旋轉蒸發去除，將剪碎后的組培苗用液氮研磨成細粉并用超聲30分鐘的方法提取，可最大程度地將組培苗中的花青苷浸提出來，真空冷凍干燥凍干花青苷粗品，避免了紅肉蘋果花青苷由于溫度和空氣中的氧接觸而降解。
需要說明的是為了大規模工廠化生產花青苷，提高組培苗花青苷含量，發明人在壯苗培養的MS培養基上分別添加了不同種類的糖進行試驗，糖種類共設8種，即：山梨醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，在不同的處理溫度下，恒溫培養14天后的組培苗，其花青苷含量分別為(甘露糖是組培苗枯萎致死，故不能測其花青苷含量)：
需要說明的是發明人為了比較經過糖和溫度處理的組培苗花青苷含量與5年生大樹的果實、葉片及花的花青苷含量的差別，測定了紅肉蘋果優系(2010-15)5年生樹不同時期不同器官的花青苷含量，請參見附圖1：其中，果糖處理的17℃條件下培養14d后組培苗花青苷含量分別是5年生結果樹花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新葉(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍。
需要說明的是：花青苷含量的測定按照Liu et al(2009)進行，將采集的葉片、花、果皮、果肉切碎后放入10ml1％Hcl/甲醇溶液在4℃冰箱中浸提24h，用分光光度計測定提取液在553nm和600nm處吸光值，以每克樣品的提取液的光密度變化值53nm-A600nm＝0.01作為一個花青苷單位，以U·g-1FW表示。
最后應說明的是：以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用于限定本發明，凡在依據本發明的技術實質所作的簡單的任何修改、等同替換、修飾等，均應包括在本發明的保護范圍之內。