風輪菜中黃酮類化合物的分離方法及黃酮組合物與流程

本發明涉及中藥組合物領域，具體而言，涉及一種風輪菜中黃酮類化合物的分離方法及黃酮組合物。

背景技術：

風輪菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)為唇形科風輪菜屬植物。在我國主要分布于山東、浙江、江蘇、安徽、福建、臺灣、湖南、湖北、廣東、廣西及云南東北部等地。風輪菜性涼，味苦辛，有疏風清熱，解毒消腫之功。用于治療感冒、中暑、過敏性皮炎、腸炎、痢疾、血尿等癥。首載于《救荒本草》(1406)草部，在我國有悠久的民間藥用歷史。現已被《中華人民共和國藥典》收載為斷血流藥用，主要用于治療各種出血癥。

目前有研究表明，風輪菜總黃酮具有顯著的活血化瘀活性，而風輪菜中的皂苷類成分又具有止血的功效，因此，風輪菜具有止血加活血的雙向作用，即在止血的同時又可以祛除已瘀之血，達到止血而不留淤的效果。所以風輪菜總黃酮在活血化瘀，治療和/或預防心血管疾病方面具有獨特的優勢，有著良好的研究開發前景。

然而，中醫所記載的總黃酮并沒有明確的化合物，且現有技術在對風輪菜中的總黃酮類物質進行提取分離時，不同研究者分離得到的黃酮類物質的種類都不盡相同。因而，到目前為止，研究人員仍然不清楚風輪菜中具有醫藥活性的總黃酮類物質具體有哪些。

因此，仍需要對現有技術進行改進，以提供一種成分相對齊全的黃酮組合物，為從風輪菜的天然產物中尋找具有良好療效的治療和/或預防心血管疾病的藥物提供物質基礎和理論依據。

技術實現要素：

本發明的主要目的在于提供一種風輪菜中黃酮類化合物的分離方法及黃酮組合物，為從風輪菜的天然產物中尋找具有良好療效的治療和/或預防心血管疾病的藥物提供物質基礎和理論依據。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種風輪菜中黃酮類化合物的分離方法，該分離方法包括以下步驟：從風輪菜的干燥地上部分提取總黃酮類物質；對總黃酮類物質采用硅膠柱色譜進行分離，在分離過程中，以體積比為100：5～100：25的氯仿和甲醇為洗脫劑進行梯度洗脫，依次得到第1流分至第320流分；對第1流分至第320流分中的第133-176流分進行硅膠柱色譜分離，以體積比依次為9:1、4:1、2:1、1:1和1:2的氯仿和丙酮為洗脫劑進行洗脫，并經薄層檢測合并相同組分，得到A1至A13共13個流分；然后以體積比為60:40 的甲醇和水作為洗脫劑，依次對13個流分進行C18反相高效液相色譜分離，分別得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35；對第1流分至第320流分中的第231-260流分進行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇和水為洗脫劑進行洗脫，并經薄層檢測合并相同組分，得到B1至B7共7個流分；然后依次對7個流分進行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，分別得到化合物6、21、22、28、29、30和33；對第1流分至第320流分中的第295-310進行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水為洗脫劑進行洗脫，并經薄層檢測合并相同組分，得到C1至C8共8個流分；依次對8個流分進行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，分別得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34；對第1流分至第320流分中的第12-48流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，并以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后經薄層追蹤檢測合并相同組分，得到D1、D2和D3共3個流分；對D2流分進行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，得到化合物13和19；對D3流分進行反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，得到化合物25；對第1流分至第320流分中的第49-55流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18。

進一步地，對總黃酮類物質采用硅膠柱色譜進行分離的過程中，利用體積比分別為100：5、100：10、100：15、100：20和100：25的氯仿和甲醇作為洗脫劑進行梯度洗脫，依次得到第1流分至第320流分。

進一步地，分離法方法還包括：對第1流分至第320流分中的第49-55流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18。

進一步地，分離法方法進一步包括：對第1流分至第320流分中的第79-86流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物7和31。

進一步地，從風輪菜的干燥地上部分提取總黃酮類物質的步驟包括：取風輪菜的干燥地上部分，用水提取得到水提液；將水提液進行壓縮、干燥，得到水提物；將水提物進行大孔樹脂層析，以乙醇和水為洗脫劑進行梯度洗脫，得到洗脫物；以及將洗脫物進行堿提酸沉法富集，然后精制得到總黃酮類物質。

進一步地，大孔樹脂層析過程中采用D101大孔樹脂層析柱進行層析；乙醇和水形成的洗脫劑中乙醇的體積濃度分別為20％、50％、70％和95％；優選得到的洗脫物為乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種黃酮組合物，該黃酮組合物包括黃酮類結構的化合物、二氫黃酮類結構的化合物、黃酮醇類結構的化合物以及異黃酮類結構的化合物；其中，黃酮類結構的化合物至少包括以下任意一種：洋芹素-7-O-蕓香糖苷、木 犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷和金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷，黃酮組合物是從風輪菜中分離得到，且黃酮類結構的化合物通過上述任一種分離方法分離得到。

進一步地，黃酮組合物中的二氫黃酮類結構的化合物至少包括以下任意一種：柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、高圣草素、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、圣草次苷、新北美圣草苷和5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷；二氫黃酮類結構的化合物通過上述任一種分離方法分離得到。

進一步地，黃酮組合物中的黃酮醇類結構的化合物至少包括以下任意一種：山奈酚-3-O-鼠李糖苷和山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷；黃酮醇類結構的化合物通過上述任一種分離方法分離得到。

進一步地，黃酮組合物包括以下35種化合物：洋芹素、洋芹素-7-O-葡萄糖苷、洋芹素-7-O-葡糖醛酸苷、洋芹素-7-O-葡糖醛酸甲酯苷、羊紅膻酯、洋芹素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷、金合歡素、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷、日本椴苷、蒙花苷、柚皮素、異櫻花素、江戶櫻花苷、柚皮素-7-O-蕓香糖苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、香蜂草苷、枳屬苷、高圣草素、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、圣草次苷、新北美圣草苷、5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷、槲皮素、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷、蘆丁和染料木苷；35種化合物通過上述任一種分離方法分離得到。

應用本發明的技術方案，通過綜合應用各種先進的色譜技術，實現對風輪菜中黃酮類化合物的有效分離。通過利用硅膠色譜載樣量大的特點，對風輪菜中的總黃酮類物質進行初步分離；利用凝膠色譜填料、MCI色譜填料和反相色譜填料無死吸附的特點，對總黃酮類物質進行進一步分離，利用高效液相色譜高分離度的特點，對性質相近的化合物進行分離，得到目前為止種類最齊全的黃酮類化合物成分。由于風輪菜中的總黃酮類物質對心肌細胞的損傷具有保護作用，本發明對風輪菜中黃酮組合物的成分進行了更全面的分離，得到了新的黃酮類成分，為黃酮組合物在治療心血管疾病的藥物中的應用奠定了物質基礎，也為風輪菜黃酮組合物在制藥中各有效活性成分含量標準的制定提供了理論依據。

附圖說明

構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1示出了根據本發明一種優選的實施例中黃酮組合物中35種化合物的結構；以及

圖2示出了本發明的黃酮組合物對缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷保護作用的檢測結果圖。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明。

在本發明中，黃酮類化合物是指具有黃酮類結構、二氫黃酮類結構、黃酮醇類結構或者異黃酮類結構的化合物。

如背景技術部分所提到的，現有技術中并不清楚風輪菜中所含的黃酮類物質的具體成分，也不清楚其中真正起到活血化瘀作用的有效成分；因而在開發治療和/或預防心血管疾病方面的藥物時也無法確定各有效成分的含量。

針對上述問題，本發明在對現代分離技術和結構測定手段進行改進的基礎上，對唇形科風輪菜屬植物風輪菜活血化瘀活性部位——風輪菜總黃酮進行了化學成分的分離和研究，并從中分離得到35種黃酮類成分，如圖1所示，這35種黃酮類成分分別為：洋芹素1，洋芹素-7-O-葡萄糖苷2，洋芹素-7-O-葡糖醛酸苷3，洋芹素-7-O-葡糖醛酸甲酯苷4，羊紅膻酯5，洋芹素-7-O-蕓香糖苷6，木犀草素7，木犀草苷8，木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷9，木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷10，木犀草素-7-O-蕓香糖苷11，木犀草素-7-O-新橙皮糖苷12，金合歡素13，金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷14，金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷15，日本椴苷16，蒙花苷17，柚皮素18，異櫻花素19，江戶櫻花苷20，柚皮素-7-O-蕓香糖苷21，柚皮素-7-O-新橙皮糖苷22，香蜂草苷23，枳屬苷24，高圣草素25，橙皮素-7-O-葡萄糖苷26，橙皮苷27，圣草次苷28，新北美圣草苷29，5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷30，槲皮素31，山奈酚-3-O-鼠李糖苷32，山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷33，蘆丁34，染料木苷35。

基于上述研究結果，在本發明一種典型的實施方式中，提供了一種從風輪菜中黃酮類化合物的分離方法。上述分離方法包含以下步驟：

取風輪菜的干燥地上部分，凈選、切段，用水進行提取。提取液經濃縮干燥后得的提取物，經D101大孔樹脂層析，以乙醇體積濃度分別為20％、50％、70％以及95％的乙醇-水為洗脫劑，得到乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物，各洗脫物經堿提酸沉法富集，精制后得到風輪菜總黃酮類物質；

風輪菜總黃酮類物質利用硅膠柱色譜進行粗分離，以體積比分別為100：5，100：10，100：15，100：20，100：25的氯仿-甲醇為洗脫劑進行梯度洗脫，依次得到第1流分至320個流分共320個流分；其中體積比為100：5的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第1-90流分；體積比為100：10的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第91-190流分；體積比為100：15的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第191-260流分；體積比為100：20的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第261-310流分；體積比為100：25的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第311-320流分；

對第12-48流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4:6的氯仿-甲醇為洗脫劑進行洗脫，薄層檢測合并相同組分，得到D1、D2和D3共3個流分。對D2流 分進行C18反相高效液相色譜分離，以體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，得到化合物13和19；對D3流分進行反相高效液相色譜分離，以體積比為60:40甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，得到化合物25；

對第49-55流分進行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后以體積比為60:40甲醇和水作為洗脫劑進行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18；

按照上述Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜和C-18反相高效液相色譜分離的條件，對第79-86流分進行分離，得到化合物7和31；

對第133-176流分進行硅膠柱色譜分離，以體積比分別為9:1、4:1、2:1、1:1和1:2的氯仿和丙酮為洗脫劑進行洗脫，然后經薄層檢測合并相同組分，得到A1至A13共13個流分；然后以體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對所得13個流分進行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35；

對第231-260流分進行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水系統洗脫，對洗脫產物進行薄層檢測合并相同組分，得到B1至B7共7個流分；然后對所得7個流分，按照上述C-18反相高效液相色譜分離條件進行分離，得到化合物6、21、22、28、29、30和33；

對第295-310流分進行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水系統洗脫，并對洗脫產物進行薄層檢測合并相同組分，得到C1至C8共8個流分；然后對所得8個流分，按照上述C-18反相高效液相色譜分離條件依次對上述8個流分進行分離，以甲醇和水作為洗脫劑進行洗脫，分別得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34。

本發明的上述分離方法，可以對其中的一種或多種新的成分進行分離，也可以同時對上述35種化合物進行分離。因而，無論是分離得到一種新的化合物成分，還是同時得到上述所有新的化合物成分，相對現有技術，都提供了種類更多、成分更齊全的黃酮類化合物，為研究風輪菜黃酮類組合物在活性化瘀和治療心血管疾病方面的具體有效藥物成分奠定更全面的物質基礎。

在本發明另一種典型的實施方式中，提供了黃酮組合物，該黃酮組合物為風輪菜的提取物，且包括黃酮類結構的化合物、二氫黃酮類結構的化合物、黃酮醇類結構的化合物以及異黃酮類結構的化合物；其中，黃酮類結構的化合物至少包括以下任意一種：洋芹素-7-O-蕓香糖苷(6)、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷(9)、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷(10)、木犀草素-7-O-蕓香糖苷(11)、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(12)、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷(14)和金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷(15)，上述黃酮類結構的化合物通過上述方法分離得到。包含了本申請的上述黃酮類結構的化合物的黃酮組合物，因具有相對較齊全的物質組成，為從風輪菜的天然產物中尋找具有良好療效的治療和/或預防心血管疾病的藥物提供了相對更豐富的物質基礎和更可靠的理論依據。

在另一種優選的實施例中，本發明的黃酮組合物在二氫黃酮類結構的化合物方面也有新的成分增加，至少包括以下任意一種：柚皮素-7-O-新橙皮糖苷(22)、高圣草素(25)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷(26)、圣草次苷(28)、新北美圣草苷(29)和5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷(30)。包含了上述二氫黃酮類結構的化合物的黃酮組合物，相比現有技術的黃酮組合物，具有相對更全面的化合物組成，有更明確的候選藥物，為真正有效天然藥物成分的選擇提供了物質基礎。更優選地，本發明的黃酮組合物既包含本發明的上述黃酮類結構的化合物，同時還包含二氫黃酮類結構的化合物。在同時增加了上述兩類成分的基礎上所得到的黃酮類組合物成分更加齊全，更有利于后續的藥物篩選和研究。同樣的，上述二氫黃酮類結構的化合物也通過上述分離方法得到。

更優選地，本發明所提供的黃酮組合物中的黃酮醇類結構的化合物至少包括以下任意一種：山奈酚-3-O-鼠李糖苷(32)和山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷(33)。上述黃酮醇類結構的化合物通過上述分離法方法得到。因包含上述新的黃酮醇類結構的化合物，該黃酮組合物在黃酮醇類結構的化合物方面具有更明確的物質組成，在此基礎上，所得到的黃酮組合物中的化合物的種類也更多，為從中篩選出治療和/或預防心血管疾病的有效成分提供了更多樣化的選擇，為確定主要有效成分提供了更詳實的物質依據。

在本發明的上述任一種黃酮組合物中，異黃酮類結構的化合物為染料木苷(35)。在本發明一種更優選的實施例中，提供了一種包含了上述35種化合物的黃酮組合物，且這35種化合物采用上述分離方法得到。該黃酮組合物是目前為止，所分離到的黃酮類化合物種類最多的組合物，為從眾多的黃酮類化合物中明確對治療和/或預防心血管疾病的有效藥物提供了物質依據，為進一步確定藥物質量標準提供依據。

下面將結合具體的實施例來詳細說明本發明的有益效果。

需要說明的是，下來實施例中所用的凝膠柱層析是指用Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱進行層析，所說的反相高效液相色譜分離是指用C-18反相高效液相色譜柱(Agilent phenyl9.4×250mm；填充物粒徑：5μm；V_MeOH:V_H2O＝40:60；檢測波長：210nm；流速：2ml/min)進行分離。

實施例1：化合物制備。

取風輪菜的干燥地上部分，凈選、切段，用水進行提取。提取液經濃縮干燥后得提取物，經大孔樹脂層析，以乙醇體積濃度分別為20％、50％、70％以及95％的乙醇-水為洗脫劑，得到乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物，再經堿提酸沉法富集，精制后即得到風輪菜總黃酮類物質。

對總黃酮類物質采用硅膠柱色譜進行分離，在分離過程中，分別用體積比為100：5、100：10、100：15、100：20和100：25的氯仿和甲醇為洗脫劑進行梯度洗脫，依次得到第1-90流分、第91-190流分、第191-260流分、第261-310流分和第311-320流分；

對第12-48流分進行羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，在羥丙基葡聚糖凝膠柱層析的過程中，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，并經薄層追蹤檢測合并相同組分，分別得到3個流分；然后以體積比為60:40的甲醇和水為洗脫劑，對第2個流分進行C-18反相高效液相色譜分離，在第28.3min得到化合物13，在第26.9min得到化合物19；同樣，以體積為60:40的甲醇：水為洗脫劑，對第3個流分進行C-18反相高效液相色譜分離，在第22.5min得到化合物25。

對第49-55流分進行羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜純化，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進行C-18反相高效液相制備色譜分離，在第24.2min得到化合物1，在第26.3min得到化合物18。

對第79-86流分進行羥丙基葡聚糖凝膠凝膠柱色譜純化，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進行洗脫，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進行C-18反相高效液相制備色譜分離，在第17.8min得到化合物7，在第20.3min得到化合物31。

對第133-176流分進行硅膠柱色譜分離，以體積比為9:1，4:1，2:1，1:1，1:2的氯仿-丙酮為洗脫劑進行洗脫，對各洗脫物經薄層檢測合并相同組分，分別得到共得13個流分，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對13個流分進行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35。

對第231-260流分經MCI柱色譜分離，以體積比分別為30:70和50:50的甲醇和水為洗脫劑進行洗脫，得到E1-E30共30個組分，經薄層檢測合并相同組分，共得7個流分；然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對7個流分進行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物6、21、22、28、29、30和33；以及

對第295-310經MCI柱色譜分離，以體積比分別為30:70和50:50的甲醇-水為洗脫劑進行洗脫，經薄層檢測合并相同組分，共得8個流分，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對8個流分經C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34。

實施例2：本發明的風輪菜黃酮組合物總黃酮對缺氧復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷的保護作用

大鼠心肌細胞H9C2以1×10⁵的密度接種于96孔板中培養36h后，風輪菜黃酮組合物(1.5625、3.125、6.25、12.5、25，50μg/ml)預處理4h，缺氧6h，復氧24h。去上清，5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)孵育4h。棄上清，每孔加150μl DMSO溶解，570nm酶標儀(Spectrafluor、TECAN、Sunrise、Austria)檢測吸光度。結果如圖2所示，其中，以正常細胞為陽性對照，以缺氧處理未加藥的細胞為陰性對照，從圖2可以看出，本發明所提供的風輪菜黃酮組合物能夠保護缺氧復氧誘導的心肌細胞死亡，且呈濃度依賴性。

從以上的描述中，可以看出，本發明上述的實施例實現了如下技術效果：本發明通過綜合應用各種先進的色譜技術，利用硅膠色譜載樣量大的特點，對風輪菜中的總黃酮類物質進 行初步分離；利用凝膠色譜填料、MCI色譜填料和反相色譜填料無死吸附的特點，對總黃酮類物質進行進一步分離，利用高效液相色譜高分離度的特點，對性質相近的化合物進行分離。由于黃酮組合物對心肌細胞的損傷具有保護作用，且本發明對風輪菜中黃酮組合物的成分進行了更全面的分離，得到了新的黃酮類成分，為黃酮組合物在治療心血管疾病的藥物中的應用奠定了物質基礎，也為風輪菜黃酮組合物在制藥中各有效活性成分含量標準的制定提供了理論依據。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。