，結構是海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微囊。
[0034]步驟B中的油水分離，在本實用新型的一個優選實施例中，在油水分離器底部添加一個大小0.5-1Τ(優選為0.6T)的磁場，更易于油水分離，并且在外加磁場條件下，可進一步縮短混合微囊的沉降時間，表現出良好的磁響應性。
[0035]步驟B得到的最終的微囊，粒徑以50—500μπι為優，直徑500μπι左右的微囊可應用于生物人工肝支持系統，直徑50μπι左右的微囊可應用于細胞治療。
[0036]步驟B中所得微囊在油水分離器中放置1min左右，可在微囊表面形成一層鈣化的外膜。
[0037]所述的步驟A中，對微囊成分進行了改進，包括加入膠原與磁性物質。所述膠原為對維持肝細胞功能有益的膠原，如Matrigel基質膠。所述磁性物質為粒徑在1nm?10ym的鐵磁性物質或順磁性物質，如鐵、鎳、四氧化三鐵等。
[0038]所述的步驟B中，分散相包括海藻酸鈉溶液和二價離子溶液;所述海藻酸鈉溶液為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉。所述二價離子溶液為能與海藻酸鈉固化成囊的二價離子溶液，如氯化鈣溶液。
[0039]所述的步驟B中，本實用新型的微流體通道，可通過微流體芯片經微加工技術建立微流體通道網絡或選擇各種針頭、聚合物管、中空纖維等粘合而成。包括一個連續相入口，注入油相液體(簡稱01);兩個分散相入口，一個注入二價離子溶液(簡稱IS)，一個注入種子細胞與海藻酸鈉的混懸溶液(簡稱AS); —個出口，將形成的微囊排出。IS與AS需以相同流速，同時達到通道內。OI流速比分散相的要快，從而可以在IS與AS相遇接觸的瞬間將其固化物夾斷，形成微囊。可以通過控制OI流速與分散相流速和調整通道直徑來精密控制微囊的大小。較優的，分散相以100ul/min的速度推注，連續相以55ml/h的速度推注。
[0040]本實用新型中凡與微囊直接接觸的溶液與設備均需無菌，微囊制備操作最好在低溫環境中進行。
[0041]本實用新型還提供了上述的人工肝細胞微流體微囊制備方法、上述的人工肝細胞微流體微囊發生裝置在制備人工肝(肝移植物)中的應用。
[0042]所述的應用，具體是將上述方法和裝置制備得到的人工肝細胞微囊，經培養后，應用于生物人工肝系統或者細胞治療。
[0043]本實用新型的有益效果是:
[0044]I)本實用新型基于微流體技術利用海藻酸鈉制備微囊，設備精簡，取材方便，操作簡單。避免了以往高速氣流、高壓靜電對種子細胞造成損傷。整個裝置可集成于一個較小的平臺中，便于全程無菌操作。
[0045]2)本實用新型的微流體微囊發生裝置可精確調控微囊大小，且穩定性高。不同大小的微囊可進行相應研究，如直徑500μπι左右的微囊可應用于生物人工肝支持系統，直徑50μπι左右的微囊可應用于細胞治療。
[0046]3)本實用新型在海藻酸鈉混合溶液中加入Matrigel基質膠，在給細胞形成生物保護膜、隔絕免疫攻擊的同時為細胞生長提供了良好的生存微環境，有利于細胞實現體外三維培養，維持功能。
[0047]4)本實用新型在海藻酸鈉混合溶液中加入磁性物質，有較高的磁響應性。如在微囊發生過程中可通過外加磁場，便于油水分離和收獲。在應用于生物人工肝灌流式反應器中，可通過外加磁場增大單位體積內微囊密度，還可對微囊進行抗重力懸浮培養。在應用于細胞治療時，可以通過外部磁場將微囊定位至病變部位，還可結合現代磁共振技術，在體追蹤微囊情況。
[0048]5)本實用新型制備得到的人工肝細胞微囊，能較長時間的維持囊內種子細胞功能，在體外肝衰竭類似血漿影響下和體內炎癥因素作用下依然能代謝有害物質，保持一定的肝功能，有望應用于生物人工肝系統和細胞治療。
【附圖說明】
[0049]圖1是一種微流體微囊發生裝置的整體結構示意圖；
[0050]圖2是圖1所示裝置中成囊組件微流體通道透視圖，右上角虛線框內為局部俯視放大圖；
[0051]圖3是本實用新型裝置發生的微囊化肝癌細胞HepG2光鏡圖，A為培養第7天10x光鏡圖^為培養第7天200x光鏡局部放大圖片，白色箭頭所示為三維化生長的H印G2細胞球；
[0052]圖4是微囊成分改良前后微囊機械強度實驗結果圖；
[0053]圖5是在微囊制備過程中磁響應性實驗結果圖；
[0054]圖6是微囊化原代肝細胞在肝衰竭類似血漿中耐受實驗結果圖，其中A為ALT檢測結果，8為431'檢測結果，(:為1]1^4檢測結果，0為1811^檢測結果(*?〈0.05，**?〈0.01，***?〈ο.οοι)ο
[0055]其中:
[0056]1-上樣推進組件 11-微量推注栗12-注射器
[0057]13-注射器14-注射器
[0058]2-成囊組件21-微流體通道接入端22-波形微流體通道
[0059]3-油水分離器31-隔板32-移液管
[0060]4-旋轉成膜臺41-網兜42-轉臺
[0061]A-收集管B-收集管C-收集管
[0062]D-收集管E-收集管F-收集管
【具體實施方式】
[0063]以下結合附圖和具體實施例，對本實用新型做進一步說明。
[0064]實施例1:一種微流體微囊發生裝置
[0065]—種微流體微囊發生裝置，如圖1、圖2所示，包括上樣推進組件1、成囊組件2、分離成膜組件3;
[0066]所述的上樣推進組件，包括微量推注栗11和三個注射器12、13、14;
[0067]所述的成囊組件，為連續的微流體通道;前端為微流體通道接入端21，內置一個連續相通道和兩個分散相通道;后端為中空的波形微流體通道22;
[0068]所述的分離成膜組件，依次包括油水分離器3和旋轉成膜臺4;所述的旋轉成膜臺由轉臺42和至少六個收集管組成。
[0069]所述的一個連續相通道與注射器14相連；
[0070]所述的兩個分散相通道分別與注射器12、13相連；
[0071 ]所述的波形微流體通道22最后伸入油水分離器3中。
[0072]實施例2:微囊化肝癌細胞HepG2的制備及培養
[0073]本實施例采用的細胞材料為肝癌細胞HepG2(HepG2細胞購自中科院細胞所)，消化離心后將HepG2細胞與1.8%海藻酸鈉混合溶液充分混勻，終濃度為5xl06個/ml，將其裝入圖1所示1ml注射器13中。注射器12中加入與注射器13等體積的1.1%氯化鈣溶液，注射器14注入大豆油。
[0074]微量推注栗11，可以控制所有注射器的上樣推進速度，較優的，注射器12與13以100ul/min的速度推注(配一個共同的微量推注栗)，注射器14以55ml/h的速度推注(單獨一個微量推注栗)。
[0075]分散相和連續相溶液在微流體通道接入端21中形成微囊，在波形微流體通道22中穩定微囊結構。
[0076]在油水分離器3中實現油水分離，用移液管32將微囊轉移至41所示的網兜中，讓網兜在42所示的轉臺中逆時針依次通過收集A0.1 %多聚賴氨酸溶液5min——收集B生理鹽水
Imin--收集C0.15%海藻酸鈉溶液1min--收集管D生理鹽水Imin--收集E55mmol/L
的檸檬酸鈉溶液1min