一種微流體微囊發生裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及組織工程和實驗室設備技術領域，特別涉及一種微流體微囊發生
目.0
【背景技術】
[0002]肝衰竭是常見的危重疾病，病情復雜，死亡率高。肝移植是治療肝衰竭較為有效的方法，但臨床上供體肝來源嚴重缺乏，很多患者在等待移植的過程中死亡。因此急需實用新型一種切實有效的生物人工肝支持系統，來暫代肝臟功能，給患者自身肝臟恢復創造一個良好的環境，或幫助患者順利過渡到移植手術期。生物人工肝支持系統中最核心的部分是種子細胞，該細胞能代替肝臟行使代謝、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自體肝細胞，然而到肝病終末期，患者自體肝細胞狀態往往很差，難以勝任此工作。國內外研究較多的種子細胞有原代豬肝細胞、功能改進后的人肝癌細胞株、IPS類肝細胞和原代異體肝細胞等。常用的二維細胞培養模式很難維持這些細胞的功能。
[0003]微囊化細胞培養技術是利用生物兼容性高分子材料形成微囊將細胞包裹在其中實現三維培養的一種技術，形成的微囊可以阻絕免疫細胞及大分子抗體進入囊內，同時允許氧氣、營養物質和一些具有生物活性的小分子物質自由出入，能較好的保護囊內細胞維持細胞活性及功能。有學者將微囊化原代豬肝細胞應用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速氣流(Sugiura S，0da T,Aoyagi Y，et al..Microfabricatedairflow nozzle for microencapsulat1n of living cells into 150micrometermicrocapsules[J].B1med Microdevices，2007，9:91一99)、高壓靜電(Willaert R G,Baron G V.Gel entrapment and micro—encapsulat1n:methods,applicat1ns andengineering principles[J].Rev Chem Eng.，1996，12:185-205)等微囊發生裝置難以得到大小穩定的微囊，且制作成本高，制作過程容易對細胞造成損傷。
[0004]微流體技術是指采用微細加工技術制作出微通道網絡結構，或者將各種微細管道把實驗室大型設備集成在盡可能小的操作平臺上，用以完成不同實驗的技術。近些年來，該技術在化學、生物學等領域得到廣泛應用，它不僅使試劑的消耗降低，而且使實驗速度提高，費用降低，充分體現了當今實驗室設備微型化、集成化和便攜化的發展趨勢(林炳承，秦建華.微流控芯片分析化學實驗室[J].高等學校化學學報，2009，03:433-445)。因此，開發基于微流體的微囊發生裝置將簡化實驗步驟，縮小實驗設備，精確控制微囊大小，減小微囊制作過程對細胞造成傷害。
[0005]海藻酸鈉凝膠因具有生物相容性好、細胞毒性較低、無免疫原性、可被生物降解、可以在適宜的條件下加工成形等優點，正被廣泛應用于制作生物醫學領域的微囊，例如甲狀腺細胞、胰島細胞、肝細胞的包囊(Prakash S.Artificial cell therapy: Newstrategies for the therapeutic delivery of live bacteria[J].Journal ofB1medicine and B1technology ,2005,44一56)。單純的海藻酸鈉微囊化肝細胞，較傳統的二維細胞培養模式能更好的維持肝細胞功能。但由于肝細胞生長的特殊性，例如貼壁生長、需要膠原支撐等，單純的海藻酸鈉微囊尚無法長時間維持其功能，離應用于生物人工肝系統還有一段距離。
【實用新型內容】
[0006]本實用新型的目的在于提供一種微流體微囊發生裝置，具體是一種人工肝細胞用微流體微囊發生裝置。
[0007]本實用新型的主要技術方案包括，利用海藻酸鈉與氯化鈣反應生成海藻酸鈣水凝膠的化學原理，通過設計微流體裝置，借助連續相液體(如豆油)對分散相液體(如海藻酸鈉與氯化鈣)的剪切力、表面張力等作用形成大小穩定的微囊，并且在海藻酸鈉凝膠中加入了膠原和磁性物質，讓其更適合種子細胞三維生長和應用于生物人工肝支持系統。
[0008]為實現上述目的，本實用新型通過以下技術方案實現:
[0009]本實用新型的第一方面，提供了一種微流體微囊發生裝置，包括上樣推進組件、成囊組件、分離成膜組件；
[0010]所述的上樣推進組件，包括微量推注栗和三個注射器；
[0011 ]所述的成囊組件，為連續的微流體通道;前端為微流體通道接入端，內置一個連續相通道和兩個分散相通道;后端為中空的波形微流體通道；
[0012]所述的分離成膜組件，依次包括油水分離器和旋轉成膜臺；所述的旋轉成膜臺由轉臺和至少六個收集管組成。
[0013]所述的微流體通道，包括采用硅、或玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷微流體芯片經微加工技術建立微流體通道網絡或選擇各種針頭、聚合物管、中空纖維等粘合而成。
[0014]所述的一個連續相通道和兩個分散相通道分別與三個注射器相連；
[0015]所述的波形微流體通道最后伸入油水分離器中；
[0016]本實用新型的一種微流體微囊發生裝置，還包括移液管，用于將油水分離器中分離得到的微囊移至旋轉成膜臺。
[0017]本實用新型的一種微流體微囊發生裝置，還包括網兜，用于盛接移液管移來的微囊，并放置于旋轉成膜臺的收集管中。
[0018]本實用新型的一種微流體微囊發生裝置，所述的油水分離器底部設置一個磁場發
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[0019]本實用新型還提供了利用上述的微流體微囊發生裝置制備人工肝細胞微液體微囊，所述的人工肝細胞微流體微囊制備方法包括以下步驟:
[0020]A、海藻酸鈉混合溶液的制備:
[0021 ]本步驟中的海藻酸鈉混合溶液，為海藻酸鈉混懸溶液未加種子細胞的溶液(即海藻酸鈉混合溶液加種子細胞后稱為海藻酸鈉混懸溶液)。
[0022]用生理鹽水溶解海藻酸鈉配制1.5% -2.0 % (質量濃度)的海藻酸鈉溶液，混入磁性物質，使磁性物質在海藻酸鈉溶液中的比例為1-5mg/mL(重量體積比，W/V，優選2mg/mL)，將此混合物用鈷60照射除菌；
[0023]再以1:15-30(優選1:26)的體積比加入MatrigeI基質膠，混合均勻，4°C冰箱保藏備用;
[0024]B、微囊的制備
[0025]分散相一，為種子細胞充分混勻于步驟A得到的海藻酸鈉混合溶液中得到分散相一(AS)；
[0026]分散相二，氯化鈣(IS)，除菌；
[0027]連續相，為不溶于水的油性介質(01)，如大豆油、甲基硅油等，除菌；
[0028]將AS、IS、0I分別裝入注射器中，用微量推注栗推注入微流體通道中；
[0029]在微流體通道中形成微囊后進入油水分離器，待微囊表面形成一層鈣化的外膜后，進行油水分離，并用生理鹽水洗滌；
[0030]移至旋轉成膜臺，優選的用網兜兜住微囊后，依次通過0.1%多聚賴氨酸溶液一一生理鹽水——0.15%海藻酸鈉溶液——生理鹽水——55mmol/L的檸檬酸鈉溶液——生理鹽水，得到最終的微囊一一人工肝細胞微流體微囊。
[0031]上述的人工肝細胞微流體微囊制備方法，還包括步驟C、將步驟B獲得的微囊置于37°C、5 % CO2培養箱中孵育。
[0032]所述的種子細胞為原代豬肝細胞、功能改進后的人肝癌細胞株、IPS類肝細胞和原代異體肝細胞等。
[0033]步驟B得到的最終的微囊