記憶損傷小 鼠海馬內TNF-α水平的影響。###ρ〈〇·〇〇1，與saline組比較；#ρ〈0·01，*#ρ〈0·001，與 LPS組比較。
【具體實施方式】
[0080] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，具有SEQ ID N0. :1所示序列 的單克隆抗體雖然分子量大，但是居然能夠非常有效地透過血腦屏障，從而對神經退行性 疾病具有良好的治療作用。具體地，本發明人發現在神經炎癥模型小鼠中，通過腹腔注射給 藥的本發明單克隆抗體和相應制劑能夠有效地抑制動物腦部小膠質細胞活化和小鼠學習 記憶能力的損傷。實驗證明，本發明單克隆抗體通過抑制炎癥因子與其受體結合來達到對 神經退行性疾病的治療作用，效果與陽性對照組相當，且該作用具有顯著的劑量依賴性。此 外，本發明單克隆抗體還能夠有效地中和TNF-α介導的細胞毒作用。
[0081] 此外，本發明還對藥物組合物進行改進，結果發現，抗TNF-α抗體（即SEQ ID NO. :1所示序列的單克隆抗體）與特定濃度的含組氨酸的緩沖體系、多元醇（如甘露醇或 山梨醇）、氯化鈉以及表面活性劑（如聚山梨酯）組成的液體制劑在pH為5. 5-6. 5的條件 下，不僅在外觀、蛋白濃度、濁度、純度等方面保持優異的穩定性，而且制劑的化學穩定性得 到顯著地提高，制劑中電荷異構體的生成速率明顯降低，制劑的存放時間得到有效延長。由 于該特定制劑的穩定性好、雜質低且不含易引起不良反應的檸檬酸等物質，因此可消除或 減輕患者的注射部位不良反應，提高病人的用藥舒適度。在此基礎上，完成了本發明。
[0082] 單克隆抗體
[0083] 如本文所用，術語"重組人抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體"、"本發明單克隆抗 體"、"抗TNF-a抗體"、"抗TNF-a單克隆抗體"可互換使用，均指序列為如SEQ ID N0. :1 所示的單克隆抗體。
[0084] 活性成分
[0085] 本發明的活性成分是指具有如SEQ ID N0. :1所示氨基酸序列的單克隆抗體，對神 經退行性疾病有顯著的治療作用。
[0086] 此外，所述術語還包括具有與治療神經退行性疾病功能的、SEQ ID N0 :1序列的變 異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：對SEQ ID N0. :1所示的序列進行1-10個，較 佳地為1-5個，更佳地為1-3個氨基酸的替換、添加或刪除。應理解，通常，在C末端和/或 N末端添加或缺失一個或數個氨基酸通常不會改變蛋白質的結構和功能。對本發明SEQ ID NO. : 1所示序列的氨基端或羧基端分別進行1-10個氨基酸的添加，并不會影響本發明多肽 的基本功能。
[0087] 在實際應用中，還可對本發明單克隆抗體進行進一步修飾以加強其穩定性。優選 的例子包括對所述多肽加入保護基團，如乙酰基、叔丁氧羰基等。
[0088] 本發明還包括附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（與前導序列、 分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的衍生蛋白）。根據本文的教導，這些片段、衍生物 和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0089] 發明還提供本發明多克隆抗體的類似物。這些類似物與本發明多克隆抗體的差別 可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類 似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具有非天然 存在的或合成的氨基酸（如β、氨基酸）的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上 述例舉的代表性的多肽。
[0090] 藥物組合物和施用方法
[0091 ] 本發明的藥物組合物包含安全有效量的本發明的單克隆抗體以及藥理上可接受 的賦形劑或載體。
[0092] 其中，"安全有效量"指的是：單克隆抗體的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴 重的副作用。通常，藥物組合物含有〇. l-l〇〇mg/kg本發明的單克隆抗體/劑，更佳地，含有 0. 3-30mg/kg本發明單克隆抗體/劑。較佳地，所述的"一劑"為一個安瓿。
[0093] "藥學上可以接受的載體"指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物 質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。"相容性"在此指的是組合 物中各組份能和本發明的單克隆抗體以及它們之間相互摻和，而不明顯降低單克隆抗體的 藥效。
[0094] 本發明的單克隆抗體或藥物組合物的施用方式沒有特別限制，代表性的施用方式 包括（但并不限于）：腸胃外給藥（如腹腔內注射劑、皮下注射劑和靜脈注射劑等）。
[0095] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0096] 本發明單克隆抗體可以單獨給藥，或者與其他藥學上可接受的藥物聯合給藥。
[0097] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的活性成分適用于需要治療的哺乳動物（如 人），其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，給藥劑量通常為20-100mg/次，優選 40-80mg/次，每1-4周給藥1次，優選每2周給藥1次。當然，具體劑量還應考慮給藥途 徑、患者病情等因素。
[0098] 高穩定性的液體制劑
[0099] 本發明還提供了一種適用于治療神經退行性疾病抗體液體制劑，它主要包括以下 組分或由以下組分構成：
[0100] ⑴治療有效量的抗TNF-α抗體（即SEQ ID NO. : 1所示序列的單克隆抗體）；
[0101] (ii)含〇· 8-6. 2mg/ml組氨酸的緩沖體系；
[0102] (iii)滲透壓調節劑；和
[0103] (iv)表面活性劑。
[0104] 其中，可用于本發明制劑中的抗TNF-a抗體包括單克隆抗體，重組抗體，單鏈抗 體，雜合抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或它們的片段。還可以使用包括一個或兩個用于結 合抗原的結合位點和免疫球蛋白的Fc-部分的抗體分子。本發明優選為單克隆抗體，本 發明所述的抗TNF-a單克隆抗體可來源以下文獻：Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen Biotechnology(N Y). 1994,12(9) :899-903)和專利：CN 1935260B。通過本領域所公知的 方法進行制備，也可以選用其它基因工程技術獲得的抗TNF-α單克隆抗體。一類優選的由 其它基因工程技術獲得的抗TNF-α單克隆抗體包括阿達木單抗（adalimumab)、英夫利昔 單抗（infliximab)、戈利木單抗（Golimumab)等。用于本發明制劑中的優選抗體是人抗體， 它是從人細胞或從代表人抗體所有組成成分的基因文庫中克隆的。特別優選的人抗體是針 對抗原TNF- α，包括人TNF- α (或hTNF α )的抗體。
[0105] 存在于本發明制劑中的抗體的治療有效量是通過考慮需要的劑量體積和施用模 式決定的。在本發明中，抗體的濃度為40-60mg/ml，優選45-55mg/ml，更優選為48-52mg/ ml，最優選為50mg/ml。本發明包括使用上述任意值的組合作為上限和/或下限的值的范 圍。
[0106] 用于本發明制劑中的緩沖體系為包含組氨酸的緩沖體系，該緩沖體系中組氨酸可 以單獨存在，或以以下形式存在，如組氨酸鹽酸鹽、組氨酸乙酸鹽、組氨酸磷酸鹽、組氨酸硫 酸鹽等。在一個優選實施方案中，緩沖體系中的組氨酸單獨存在或以組氨酸鹽酸鹽形式存 在。
[0107] 本發明的滲透壓調節劑主要由多元醇和氯化鈉組成，其中"多元醇"是具有多個羥 基的物質，并且包括糖（還原糖和非還原糖），糖醇和糖酸。"還原糖"是包括半縮醛基的糖， 它能夠還原金屬離子或與蛋白中的賴氨酸和其他氨基共價反應，而"非還原糖"是不具備還 原糖的上述特征的糖。還原糖的例子包括果糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖。非 還原糖包括蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖和棉子糖。糖醇的例子包括甘露糖醇，木糖醇，赤 蘚糖醇，蘇糖醇，山梨糖醇和甘油。至于糖酸，包括L-葡糖酸和它的金屬鹽。如果需要所述 制劑是凍-融穩定的，所述多元醇優選是在冷凍溫度（例如，-20°C)下不會結晶的，以便它 使所述制劑中的抗體去穩定化。
[0108] 多元醇的用量可以根據所需要的制劑的等滲性而改變。本發明的制劑優選是等滲 透的。所添加的多元醇的量還可以根據多元醇的分子量而改變。本發明優選的多元醇為 糖醇。在本發明的優選實施方案中，多元醇為甘露醇或山梨醇，甘露醇或山梨醇的濃度為 8-20mg/ml，更優選為l〇-15mg/ml，更優選為ll-13mg/ml，本發明包括使用上述任意值的組 合作為上限和/或下限的值的范圍。
[0109] 氯化鈉的濃度為2-10mg/ml，優選為4_8mg/ml，更優選為5. 5-6. 5mg/ml。
[oho] 本發明制劑中的表面活性劑優選非離子表面活性劑，如失水山梨醇聚氧乙烯醚脂 肪酸酯（例如失水山梨醇聚氧乙烯（20)醚月桂酸酯，失水山梨醇聚氧乙烯（20)醚油酸酯 等）或泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188)。所添加的表面活性劑的量使其能減少制劑中的抗 體的聚集和/或減少顆粒在制劑中的形成和/或減少吸附。在本發明的優選的表面活性劑 為聚山梨酯，如吐溫80。在一優選的實施方案中，聚山梨酯的濃度為0. 6-1. Omg/ml，優選為 0. 8-1. Omg/ml，更優選為0. 9-1. Omg/ml。本發明包括使用上述任意值的組合作為上限和/ 或下限的值的范圍。
[0111] 本發明通過緩沖體系來調節制劑的pH值，以控制pH在5. 5-6. 5的范圍內，在某些 實施方案中，制劑的pH處于5. 5至6. 4、5. 6至6. 3、5. 7至6. 2、5. 8至6. 1、5. 9至6. 0之間， 本發明包括使用上述任意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。在一些優選的實施方 案中，制劑 pH 為 5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4 或 6. 5。
[0112] 應理解，本發明的緩沖體系除包括組氨酸以外，還可進一步包括一種或多種其他 緩沖組分，通過與其他緩沖組分的組合將制劑的pH值控制在上述范圍。適合的其他緩沖組 分包括檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽（例如乙酸鈉），琥珀酸鹽（例如琥珀酸鈉）等。
[0113] 本發明優選的實施方案中，緩沖體系為組氨酸一鹽酸，其中組氨酸濃度為 0· 8-6. 2mg/ml，優選為1. 6-5. Omg/ml，更優選為3. 0-3. 8mg/ml。本發明包括使用上述任意 值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。在另一種實施方案中，所述制劑的pH是用檸檬 酸、乙酸或磷酸等無機酸調節的。
[0114] 發明人經過大量的實驗和數據篩選發現，當本發明制劑中組氨酸的濃度低于 0. 8mg/ml時，緩沖體系的緩沖能力將受到明顯的限制，當組氨酸的濃度高于6. 2mg/ml時， 對制劑穩定性并無提高作用，并且可能引起不良反應。
[0115] 此外，發明人經過反復的試驗，對各類緩沖體系的組分及含量進行了大量的篩選， 并最終從大量的緩沖體系中篩選得到了本發明的組氨酸體系，并且發現在該體系中，抗體 蛋白的穩定性明顯提高。
[0116] 本發明的制劑中可包括一種或多種其它藥學可接受載體、賦