低于〇.7mg。
[0067] 9.如7所述的具有引發增強免疫反應與改變免疫反應類型作用的免疫原組合物的 制備方法，是將雙鏈聚核巧酸一E -聚賴氨酸復合物與抗原物相互混合，而制成組合物。
[0068] 10.如7所述的具有引發增強免疫反應與改變免疫反應類型作用的免疫原組合物 可W通過下列給藥途徑中的一種途徑給藥于人類或動物，該給藥途徑包括肌肉注射、腹腔 注射、靜脈注射、皮下注射、經呼吸道吸入、直腸給藥、陰道給藥、經口給藥、經鼻給藥、經眼 給藥、透皮或皮內給藥。W下通過方案設計和測試方法說明本發明。
[0069] 復合物：指由兩種或兩種W上不同物質所形成的結合體。當復合物表現與其中各 單一組分所具有的性質迴異的化學、機械和物理方面的特性時，運些組分仍保持著各自的 原始性質。本發明所指雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物是含有雙鏈聚核巧酸與陽離子E-聚賴氨酸及金屬陽離子相互復合而成的復合物。所指免疫原組合物包含該雙鏈聚核巧酸一 E-聚賴氨酸復合物和抗原(例如此二種成份位于一疫苗內）。
[0070] 我們嘗試制備一種具有免疫調節作用的雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸-復合物，希 望該類復合物即保留及增強免疫調節的藥理活性，又通過復合物的所具有的特性，使其有 良好的水溶性，并具有一定的抗生物酶水解作用。
[0071] 雙鏈聚核巧酸的篩選條件是陰離子的雙鏈聚核巧酸或雙鏈聚核巧酸衍生物，即帶 有負電荷的雙鏈聚核巧酸。
[0072] 為增加雙鏈聚核巧酸的緊密度，在雙鏈聚核巧酸-E-聚賴氨酸復合物中添加金屬 陽離子可溶性鹽，如CaCl2，其終濃度為0.2mmol-4mmol/Leai 2\Mg2\Mn2+二價金屬離子與 化有類似的作用。
[0073] 該復合物的復合主要是利用物質所帶電荷性質相反而進行復合。雙鏈聚核巧酸 與E-聚賴氨酸的優選比例是雙鏈聚核巧酸的憐酸根所具有的陰離子電荷數與E-聚賴氨酸 的氨基所具有的陽離子電荷數比為1:1。
[0074] 根據人或動物體所能廣泛接受的pH值范圍，該復合物優選抑范圍是7.0-8.0。
[0075] 我們嘗試將符合篩選條件的上述雙鏈聚核巧酸、陽離子E-聚賴氨酸及金屬陽離子 制成復合物。
[0076] 為達到此目的，本發明的所設及的雙鏈聚核巧酸和陽離子E-聚賴氨酸可W是先W 固體形態充分混合，再添加溶劑進行復合反應，也可W用固一液形態、液一液形態進行復 合，反應物添加量、添加順序、反應條件可適當進行調整。
[0077] 因此，收集了雙鏈聚核巧酸:人工合成的典型代表物:polyI:C(沉降系數含4S)、天 然提取的典型代表物:雞傳染性法氏囊病毒RNA;陽離子E-聚賴氨酸;CaCb。然后按本發明 內容所述制備方法進行復合物制備(每種復合物具體制備方法詳見各實施例）。
[0078] 各實施例所制具有免疫調節作用的雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物將按W下 全部或部分質量檢測方法進行檢測。
[0079] 1、雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物性狀檢查:澄清透明溶液。
[0080] 2、雙鏈聚核巧酸一E -聚賴氨酸復合物異常毒性檢測：按《中國藥典》方法檢查，小 鼠應健存。
[0081] 3、雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物抗核酸酶降解能力檢測：
[0082] 向單獨雙鏈聚核巧酸、市售聚肌胞、雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物中分別加 入RNase(其反應體系中每毫升含雙鏈聚核巧酸40iig、RNase IOiig)，于室溫消化。根據RNase 可使雙螺旋結構核酸雙鏈水解，而產生增色效應，且水解程度越大，增色效應越甚的原理， 每15min檢測在A248nm處的吸光度值，復合物組W對應的無雙鏈聚核巧酸的e -聚賴氨酸溶 液作空白。
[0083] 4、雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物干擾素誘導效果檢測：
[0084] 取15只21日齡小雞隨機分為S組，每組10只（雙鏈聚核巧酸為法氏囊病毒RNA的復 合物組用小雞2只），一組注射各實施例制備的雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物、第二組 注射市售聚肌胞、第S組注射O.Olmol/L的PBS溶液作為對照組。每只雞按0.OlmVKg體重注 射，間隔S天再注射一次，在最后一次注射12小時、36小時后采血，用ELISA方法測定血液中 的曰干擾素含量。
[0085] 5、雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物抗病毒效果檢測：
[0086] 取用9-llg KM系小白鼠90只，分為S組，用乙型腦炎病毒(P 3株，6.51ogLD50/ml) 腹腔攻擊小白鼠，0.3ml/只，于感染后12小時，第一組小白鼠用0.05ml/只的PBS、第二組小 白鼠用0.05ml/只的市售聚肌胞、第S組小白鼠用0.05ml/只的雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸 復合物皮下注射治療小白鼠，每日1次，連續3次。自攻毒日起，連續觀察21天，記錄小鼠死亡 率。
[0087] 6、雙鏈聚核巧酸-E-聚賴氨酸復合物與抗原物制成的免疫原組合物使用效果檢 測：
[0088] 將所制備的雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物制劑與滅活狂犬病毒抗原按7:3的 比例充分混合，然后按狂犬病疫苗效價測定法(NIH法)進行效價檢測，W市售聚肌胞+疫苗 為對照組，WO. 3ml/劑的滅活狂犬病毒抗原作為單純疫苗對照組。
[0089] 各雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸復合物的具體制備及雙鏈聚核巧酸一E-聚賴氨酸 復合物、免疫原組合物有關質量檢測結果詳見【具體實施方式】。
【具體實施方式】
[0090] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但應理解本發明的范圍非限于運些 實施例的范圍。
[0091] 實施例1
[0092] a、0.1mol/L的氯化巧溶液制備：
[0093] 稱取無水氯化巧I. IlOg用100mL注射用水溶解，并經0.2WI1孔徑的濾膜過濾除菌制 成0.1mol/L的氯化巧溶液。
[0094] b、0.0 Imo 1 /L的 PBS 溶液(pH=7.6)制備：
[00M]分別稱取憐酸氨二鋼0.124g、一水合憐酸二氨鋼O.OlSg、氯化鋼0.808g，混合后用 100mL注射用水溶解，并經0.2皿孔徑的濾膜過濾除菌制成0.0 lmol/L的PBS溶液(抑=7.6)。
[0096] C、2mg/m 1的化1 y IC中間體溶液制備：
[0097] 稱取1.008?的化IyI、0.991?的PolyC分別加400ml的PBS溶液進行溶解，合并兩 液，混合搖勻，補加PBS溶液至1000ml，置45°C水浴60分鐘后，經0.45皿孔徑的濾膜過濾除菌 制成2mg/ml的化Iy IC中間體溶液備用。
[009引d、lOmg/ml的e -聚賴氨酸溶液制備：
[0099] 稱取E-聚賴氨酸1.OOOg用100mL的PBS溶液進行溶解，并經0.45皿孔徑的濾膜過濾 除菌制成lOmg/ml的E-聚賴氨酸溶液。
[0100] e、pH值調節液制備：
[0101] 稱取氨氧化鋼4.Og用100mL注射用水溶解，并經0.2WI1孔徑的濾膜過濾制成抑值調 節液。
[0102] f、PolパC-e-聚賴氨酸復合物制備：
[0103 ] 在4 °C下進行操作，首先向50ml的化Iy IC中間體溶液中邊攬拌，邊滴加3.83ml的e - 聚賴氨酸溶液，之后向上述混合液中邊攬拌，邊滴加0.4ml的氯化巧溶液。補加PBS緩沖液至 100ml，同時用pH值調節液調節pH至7.6,并在4°C下連續攬拌12小時后將復合物溶液分裝于 密封容器中，沸水浴30分鐘，然后將密封容器置水流中迅速降至室溫，沸水浴30分鐘，然后 將密封容器置水流中迅速降至室溫，最后經0.45WI1孔徑的濾膜過濾除菌制成無菌的 PolyIC-E-聚賴氨酸復合物制劑。
[0104] 實施例2
[01化]a、0.1mol/L的氯化巧溶液制備：
[0106] 稱取無水氯化巧1. IlOg用100mL注射用水溶解，并經0.2WI1孔徑的濾膜過濾除菌制 成0.1mol/L的氯化巧溶液。
[0107] b、0.01mol/L的PBS溶液(pH=7.6)制備：
[0108] 分別稱取憐酸氨二鋼〇.124g、一水合憐酸二氨鋼O.OlSg、氯化鋼0.808g，混合后 用1 OOml注射用水溶解，并經0 .化m孔徑的濾膜過濾除菌制