4] 4熒光定量PCR
[0095] mRNA的RT-PCR體系的配制：
[0098] mRNAs的表達檢測每次設置3個平行管反應，以actin作為內參。
[0099] 擴增程序為:95。1〇1^11，45個循環(95。(：158,6〇1€6〇8)。
[0100] miRNA的RT-PCR體系的配制：
[0102] miRNAs的表達檢測每次設置3個平行管反應，以snRNA U6作為內參。
[0103] 擴增程序:95°C lOmin; 40個循環(95°C 10s，60°C 30s)。
[0104] 5統計學分析
[0105]實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效 率相近，極限平而無上揚現在，曲線指數期斜率較大，說明擴增效率較高;樣本擴增產物溶 解曲線都是單峰，說明擴增產物只有一條，為特異性擴增;根據qRT-PCR的相對定量公式:2-ACtXlOO%，比較DST基因在骨肉瘤組和正常組中的表達水平。結果顯示:qRT-PCR擴增結 果穩定，其中1^1?-1292-5口在骨肉瘤轉移組表達水平明顯高于正常對照組，約是對照的4.5 倍(具體見圖1)，而DST在骨肉瘤轉移組中的表達水平明顯低于正常對照，約是對照的四分 之一(具體見圖2)，以上結果驗證了高通量轉錄組表達數據的整合分析的結果。
[0106] 實施例4 miR-1292與DST靶基因關系驗證 [0107] 一、材料準備：
[0108]( - )標本來源
[0109]人骨肉瘤細胞系MG-63購自中科院上海細胞研究所。
[0110](二）主要試劑
[0111] LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen)〇
[0112] DST 引物設計(NM_183380.3):
[0113] DST擴增引物：
[0114] 正向引物：5'-GAATCCTCCAATAATCTAACC-3'SEQ ID NO 4
[0115] 反向引物：5'-CAAGAACACTGACCATAAG-3'SEQ ID NO 5
[0116] 擴增產物長度91bp。
[0117] miR-1292_5p序列發給合成公司，請其化學合成miR-1292_5p mimics及非特異性 對照。
[0118](三)主要溶液 [0119] 1、細胞培養液
[0120] DMEM培養基+10%標準胎牛血清。
[0121] 2、PBS (平衡鹽溶液）
[0122] 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HP04和0.24g KH2P04用HC1 調節溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。
[0123] 3、0.25 %胰蛋白酶消化液
[0124] 0.25g胰蛋白酶加入100ml去離子水中，濾器過濾滅菌，分裝備用。
[0125] 二、實驗方法
[0126] 1、細胞傳代
[0127] (1)將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去，加入0.25 %胰蛋白酶液lml，覆蓋 細胞層，瓶口消毒，加蓋；
[0128] (2)倒置顯微鏡下觀察細胞變化，隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形， 細胞間質回縮，細胞間隙加大，在還未漂起時將胰酶棄去，加入5ml含10%胎牛血清的培養 液終止消化；
[0129] (3)細胞計數:取上述細胞懸液0.5ml，適當稀釋后滴入血細胞計數板內，按白細胞 計數法數四角四大格內細胞總數，計數時僅計數細胞核和細胞漿完整的細胞，成堆的細胞 按一個細胞計算，將4大方格內的細胞總數按下列公式換算成每毫升細胞懸液中的細胞數： 細胞總數/ml = 4大格細胞總數/4 X 104 X稀釋倍數；
[0130] (4)根據細胞計數結果，用DMEM完全培養液進一步稀釋為每毫升含3 X105個細胞 濃度，分裝于培養瓶中（8ml/每瓶），放置于37°C，5%C〇2培養箱中培養。
[0131] 2.miRNA 瞬時轉染
[0132]采用陽離子脂質體法進行瞬時轉染，操作按照Lipofectamin?2000試劑說明書進 行。轉染前24h將生長狀態良好的細胞接種到12孔板中，細胞計數約2 X104,常規培養至轉 染當天，細胞融合度為50-60%時進行試驗。將20nM/40nM/80nM miRNA mimic加入到100ul DMEM培養基中，輕柔混勻；另用100ul DMEM培養基稀釋2ul Lipofectamin?2000脂質體，輕 柔混勻，室溫孵育5min;混合DMEM-脂質體與DMEM-miRNAs，室溫孵育20min，以形成轉染復合 物;然后將上述混合物加到細胞培養基中，輕輕混勻，培養6h后更換完全培養基。其中，非特 異性序列作為陰性對照。培養48h后提取細胞總RNA進行下一步實驗。
[0133] 3.實驗結果：
[0134] 將miR-1292-5p mimics轉染至人骨肉瘤細胞株MG-63中，48h后提取細胞總RNA，空 白對照為未轉入miRNA的人骨肉瘤細胞株細胞，非特異性序列作為陰性對照。定量PCR檢測 靶基因DST的mRNA的水平變化。結果顯示基因下調明顯，表明DST是miR-1292-5p的靶基因。 [0135]雖然已參考各種優選實施方案描述了本發明，但本領域技術人員理解，可進行各 種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發明的基本范圍。此外，可進行許多改動來 使特定情況或材料適合于本發明的教導而不背離其基本范圍。
[0136]因此，本發明無意限定于本文中公開的用于進行本發明的特定實施方案;相反地， 本發明意欲包括落在權利要求書范圍內的所有實施方案。
【主權項】
1. 一種防治骨肉瘤試劑，所述試劑包含： (a) 抑制劑和/或抑制劑組合物，所述抑制劑和/或抑制劑組合物下調mir-1292和/或其 成熟miRNA的轉錄和/或阻斷mir-1292和/或其成熟miRNA的活性； (b) 藥劑學上能接受的載體。 2. mir-1292和/或其成熟miRNA在制備診斷和/或防治骨肉瘤試劑中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，診斷骨肉瘤試劑包括基于高通量測序方法 和/或基于定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟 miRNA的轉錄或基于免疫檢測方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292調控的靶基因的表達情況， 優選采用northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基 于微球的流式細胞術檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄;采用ELISA和/ 或膠體金試紙條檢測骨肉瘤樣本中mir-1292調控的靶基因的表達情況。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，調控的靶基因為DST基因。5. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，防治骨肉瘤試劑包括下調mir-1292和/或 其成熟miRNA的轉錄和/或抑制mir-1292和/或其成熟miRNA的活性的試劑。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海 綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點反義寡核苷酸的方法下調mir-1292和/或 其成熟miRNA的轉錄和/或阻斷mir-1292和/或其成熟miRNA的活性。 7. mir-1292和/或其成熟miRNA的靶基因在制備診斷和/或防治骨肉瘤制劑中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，靶基因為DST。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，診斷骨肉瘤制劑采用熒光定量PCR試劑盒、 基因芯片、免疫方法檢測外周血中DST基因的表達。10. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，防治骨肉瘤的制劑中含有促進DST基因的 轉錄或表達的試劑或化合物。
【專利摘要】本發明涉及mir-1292及其靶基因在預防和治療骨肉瘤轉移中的應用，更具體的涉及mir-1292和/或miR-1292-5p及其靶基因DST在診治骨肉瘤中的新用途。發明對轉移性骨肉瘤患者及正常對照進行高通量測序分析，獲得其miRNA和mRNA的表達數據，選取后備miR-1292-5p及其靶基因DST進行分子生物學驗證及靶標驗證，結果顯示，本發明提供的miR-1292-5p及其靶基因DST與骨肉瘤轉移密切相關，可用于臨床診斷及預防檢測，具有很好的臨床應用價值。
【IPC分類】A61K31/7088, A61K48/00, G01N33/574, A61P35/00, C12Q1/68
【公開號】CN105561341
【申請號】CN201610003247
【發明人】楊祚璋, 李曉娟, 李東奇, 陳彥錦, 楊義豪
【申請人】楊祚璋
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月4日