mir-1292及其靶基因在預防和治療骨肉瘤轉移中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體的涉及mir-1292及其靶基因在預防和治療骨肉 瘤轉移中的應用，更具體的涉及mir-1292和/或miR-1292-5p及其靶基因DST在診治骨肉瘤 中的新用途。
【背景技術】
[0002] 骨肉瘤是常見的原發性惡性腫瘤之一，約占全部骨科腫瘤的15%左右，多發生在 青少年，社會危害極大。化療方案和手術方式改進使得生存率得到逐步提高，但是近十年來 骨肉瘤的生存率沒有得到進一步地改善，這其中早期轉移是一個重要限制因素。骨肉瘤發 病特點是絕大多數骨肉瘤在診斷時己經成為高等級的惡性腫瘤，超過15%的患者出現臨床 肺轉移病灶，由于現在的檢測手段限制，80%的患者微小轉移病灶無法查出。骨肉瘤的原發 病灶患者生存率在65%左右，一旦出現轉移，骨肉瘤的生存率只有25%，甚至更低。研究揭 示骨肉瘤轉移機制是臨床中迫切需要解決的重大問題。
[0003] miRNA通常由RNA聚合酶II(Pol II)轉錄生成。Pol II結合在以后形成發夾結構的 頸環DNA序列附近。生成的轉錄本經修飾添加5'帽子結構和3'末端多腺苷酸尾巴結構，并剪 切，生成的產物稱為初級miRNA(pri-miRNA)，該產物可能長達數千或數百核苷酸，隨后進一 步生成前miRNA(pre-miRNA)，在胞衆中，pre-miRNA發夾結構經RNase III Dicer切割處理。 這種內源性核糖核酸酶(endoribonuclease)與發夾結構的3'相互作用并在環的3'和5'臂 上完成切割，產生長約22nt并不完美匹配的miRNA:miRNA*雙鏈結構。
[0004] miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數情況下，復合物中的單鏈 miRNA與祀mRNA的3 ' UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調芐基因表達。這種方式 主要影響蛋白表達水平，并不影響mRNA的穩定性。另一種作用方式與siRNA類似，當miRNA與 mRNA完全互補配對時，Ag〇2蛋白通過切割mRNA直接導致其降解，實現基因沉默。總之，當前 認為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程度有關。miRNA與目的 基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達發揮作用;miRNA與目的基因某段序列 配對完全時，就可能引起目的基因在互補區斷裂而導致基因沉默。另外，miRNAs有時候也導 致組氨酸修飾和啟動子區的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達。
[0005] 發明基于高通量測序方法，對5例轉移性骨肉瘤患者及10名正常人進行測序，獲得 其miRNA和mRNA的表達數據，進而進行生物信息學分析，選取后備miRNA和mRNA進行分子生 物學驗證及靶標驗證，結果顯示，本發明提供的miRNA和mRNA與骨肉瘤密切相關，可用于臨 床診斷及預防檢測，具有很好的臨床應用價值。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供mir-1292和/或其成熟miRNA在制備診斷和/或防治骨肉瘤 試劑中的應用。
[0007] mir-1292的序列見序列表SEQ ID NO Umir-1292的成熟miRNA為miR-1292-5p和 miR-1292-3p序列見序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3。
[0008] 進一步的，所述骨肉瘤為轉移性骨肉瘤。
[0009] 進一步，所述的診斷骨肉瘤試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法 和/或基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄或基于免疫 檢測方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292調控的革E1基因的表達情況，優選采用northern雜交方 法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細胞術檢測 骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測骨肉 瘤樣本中-^292調控的靶基因的表達情況。優選所述mir-1292調控的靶基因為DST〇 [00 10]優選的，所述的基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-1292和/或其成熟miRNA的 引物，進一步優選，特異性擴增mir-1292成熟miRNA的引物序列為SEQ ID N0 6;所述的基于 探針雜交方法包括與mir-1292和/或其成熟miRNA的核酸序列雜交的探針;所述免疫檢測方 法包括與mir-1292調控基因表達蛋白特異性結合的抗體，進一步優選與DST蛋白特異性結 合的抗體。
[0011] 進一步，所述的防治骨肉瘤試劑包括下調mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄和/ 或抑制mir-1292和/或其成熟miRNA的活性的試劑。
[0012] 優選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點反義寡核苷酸的方法下調mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄和/或阻 斷mir-1292和/或其成熟miRNA的活性。
[0013] 本發明的目的還在于提供一種防治骨肉瘤試劑，所述試劑包含：
[0014] (a)抑制劑和/或抑制劑組合物，所述抑制劑和/或抑制劑組合物下調mir-1292和/ 或其成熟miRNA的轉錄和/或阻斷mir-1292和/或其成熟miRNA的活性；
[0015] ⑻藥劑學上能接受的載體。
[0016]優選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點反義寡核苷酸的方法下調mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄和/或阻 斷mir-1292和/或其成熟miRNA的活性。
[0017]進一步的，所述骨肉瘤為轉移性骨肉瘤。
[0018] 本發明的目的在于提供一種骨肉瘤診斷試劑，所述骨肉瘤診斷試劑能夠檢測骨肉 瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄或免疫檢測方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292 和/或其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況。
[0019] 進一步，所述骨肉瘤診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄或基于免疫方法 檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況，優選采用 northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術、RAKE法、原位雜交、基于微球的 流式細胞術檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA的轉錄;采用ELISA和/或膠體金 試紙條檢測骨肉瘤樣本中mir-1292和/或其成熟miRNA調控的靶基因的表達情況。優選所述 mir-1292和/或其成熟miRNA調控的靶基因為DST蛋白，ELISA和/或膠體金試紙條中含有與 DST蛋白特異性結合的抗體。
[0020] 本發明的目的在于提供mir-1292的靶基因在制備診斷和/或防治骨肉瘤制劑中的 應用。優選的，靶基因為DST。
[0021] 進一步的，所述骨肉瘤為轉移性骨肉瘤。
[0022] 進一步，所述診斷骨肉瘤制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法檢測 骨肉瘤患者外周血中DST基因的表達。優選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一對特異 性擴增DST基因的引物;所述的基因芯片中包括與DST基因的核酸序列雜交的探針。更優選 的，焚光定量PCR試劑盒內含有特異性檢測DST基因的上游引物和下游引物，上游引物序列 為SEQ ID N0 4,下游引物序列為SEQ ID N0 5。
[0023] 進一步，所述的骨肉瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測骨肉瘤外周血中DST基因的 表達產物。優選的，所述免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。進一步，所述檢測DST蛋白 的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市售的DST單克隆抗體或 多克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括:包被DST抗體的固相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋 白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應終止液等。
[0024] 進一步，所述檢測DST蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用市售 的DST單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技 術或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區（T)噴點有 抗DST抗體、質控區(C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0025] 本發明的目的在于提供上述骨肉瘤診斷制劑在制備骨肉瘤診斷工具中的應用。 [0026]本發明的目的在于提供一種防治骨肉瘤的制劑，所述制劑中含有促進DST基因的 轉錄或表達的試劑或化合物。進一步的，所述的DST基因和/或基因的表達產物在骨肉瘤組 織中低表達。
[0027]本領域人員熟知促進基因及其表達產物的表達通常可以采用下述方法中的一種 和/或幾種:激活分子標志物的啟動子、激活分