一種膠原基貽貝仿生黏附性水凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物醫用材料領域，具體涉及一種膠原基貽貝仿生黏附性水凝膠及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 貽貝仿生黏附材料因其廣闊的市場應用前景，可用于外傷、手術和整形等導致的 皮膚、肌肉、骨骼等損傷處的黏結與修復而受到廣大科技工作者的追捧。貽貝仿生黏附材料 的外在形式主要包括膜狀、海綿狀和水凝膠狀，由于水凝膠狀材料具有親水的聚合物網絡， 與細胞所處正常生理環境相似，頗受組織和細胞親睞，因此，水凝膠狀的貽貝仿生黏附材料 的研究最為集中也最為廣泛。
[0003] 理想的生物黏附材料既要滿足一般黏附材料的黏附性能要求，又要面對生物醫學 應用中的特殊需求：良好的生物相容性，優異的生物誘導作用和嚴苛的使用環境(例如干/ 濕條件下的不同界面）。近年來，人們為解決當前各種合成高分子類生物黏附材料存在的諸 多問題(例如生物相容性不夠，潤濕條件下黏附性能不夠理想，生物誘導作用欠缺等），逐步 將研究工作聚焦于生物的黏附行為，以期從仿生的角度來實現這一目標，貽貝就是這類生 物的典型代表。貽貝是一種大量生長在海洋及沿海地區的軟體動物，通過分泌貽貝黏附蛋 白（MAPs)可以在潮濕的環境中與基體材料表面形成很強的相互作用，其氨基酸序列中含有 近30%的L-多巴和15%的賴氨酸殘基。盡管從貽貝中直接提取MAPs或者采用基因重組技術 來制備重組貽貝黏附蛋白在科學研究中也取得了較為不錯的成績，但是存在提取過程繁 瑣、成本較高、產率不足的固有局限，因此，采用高分子仿生的方法合成含有仿貽貝黏附蛋 白功能元(3，4-二羥基苯丙胺，多巴胺，Dopamine)的貽貝仿生黏附材料成為當前研究的熱 點。王堯等利用四臂聚乙二醇為主體分子，在其結構中通過偶聯反應引入多巴胺以及雙硫 鍵，合成了端基功能化的基于PEG的凝膠因子(PEG-多巴胺）貽貝仿生黏附性水凝膠（王堯 等.基于PEG-D0PA的可降解水凝膠的制備與性質[J].高分子通報，2014，8:84-89);張峰等 通過1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(EDC)將多巴胺的自由氨基通過酰胺鍵接 枝到聚丙烯酸酯上，制備了含多巴胺的貽貝仿生聚丙烯酸酯黏附材料，多巴胺的引入大幅 提升了丙烯酸酯的黏附性和親水性（張峰等.多巴胺改性聚丙烯酸酯的合成及性能研究 [J].材料研究與應用，2010,4(4):711-715);亦有報道，采用EDC將多巴胺與含羧基的聚氨 酯結合制備含多巴胺的貽貝仿生聚氨酯黏附材料，其對金屬的黏附強度提高了 30%左右， 并可與價格昂貴的貽貝黏附蛋白相媲美(孫培育等.含多巴胺的貽貝仿生聚氨酯[J].高分 子學報，2009,8:803-808);更有將多巴胺與胺化或羧基化的聚異丙基丙烯酰胺和聚乙烯醇 等高聚物僅通過非共價鍵結合，制備基于合成高分子的貽貝仿生黏附膜材料，考察其對各 類蛋白質和細胞的黏附能力（ZhangY，etal.Assemblyofpoly(dopamine)/poly(N-isopropylacrylamide)mixedfilmsandtheirtemperature-dependentinteraction withproteins，Liposomes，andCelIs[J] ·Langmuir，2013，29(32): 10213-10222)。但是這 些合成高分子隸屬于生物惰性組分，在終產物的生物誘導作用和生物相容性方面，仍不盡 如人意。
[0004]隨著貽貝仿生黏附材料的不斷發展，人們對貽貝仿生生物黏附材料的要求不再局 限于黏附性能，逐步加大了對生物誘導作用的重視。有報道將絲素通過碳化二亞胺鹽酸鹽 與L-多巴通過共價鍵結合的方式偶聯起來，以期獲得兼具生物相容性和黏附作用的貽貝仿 生黏附膜材料(高動動.多巴仿生粘附材料的制備及其應用[D]. 2013,東華大學，碩士畢業 論文）；Lee課題組將牛血清蛋白通過多巴胺引入到了鈦合金基底材料表面，制備了具有較 好生物礦化表面的貽貝仿生鈦合金功能膜黏附材料(RyuJ.B.，etal.Mussel-inspired polydopaminecoatingasauniversalroutetohydroxyapatitecrystallization [J].AdvancedFunctionalMaterials，2010,20(13) :2132-2139) ;Chen等將殼聚糖等通過 自然涂覆的方式引入到了預先浸潤了多巴胺溶液的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)膜表 面，制備了具有良好成骨誘導生長作用的貽貝仿生PLGA黏附膜材料，但是該研究限于膜材 料方向，且合成高分子PLGA為膜材料主體（ChenG，etal.Effectsofsurface functionalizationofPLGAmembranesforguidedboneregenerationon proliferationandbehaviorofosteoblasts[J].JournalofBiomedicalMaterials ResearchPartA，2013，101 (1): 44-53);楊茜將多巴胺與膠原的降解產物明膠通過偶聯劑 化學鍵合，制備了基于多巴胺修飾的明膠基黏附材料，并將之用于植入金屬材料表面的細 胞黏附與生長，但明膠的生物活性已被大量證實遠不如膠原(楊茜.多巴結構用于材料表面 的仿生修飾及其生物學基礎研究[D].2014,吉林大學，博士畢業論文）。
[0005]綜上所述，當前專利文獻或非專利文獻多局限于合成高分子與多巴胺的相互作 用，終產物生物誘導作用有限，在生物活性天然高分子的貽貝仿生設計上不盡如人意，尤其 是在膠原基貽貝仿生黏附性水凝膠及其制備方法方面尚未見諸報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有技術存在的問題，提供一種膠原基貽貝仿生黏附性水凝 膠及其制備方法。該方法不僅使所制備的貽貝仿生黏附性水凝膠相對于從貽貝足絲中提取 的黏附蛋白價格更低，而且兼具膠原優異的生物活性。不僅開發了新的仿生黏附性水凝膠 材料，而且為淡水魚膠原的高值轉化開辟了新的領域。本發明所制備的膠原基貽貝仿生黏 附性水凝膠，其化學組成主要為淡水魚膠原、多巴胺和交聯劑，其中淡水魚膠原為100份，多 巴胺為1~20份，交聯劑為1~10份。優選地，淡水魚膠原為100份，多巴胺為2~12份，交聯劑 為5~9份。進一步的優選，淡水魚膠原為100份，多巴胺為10份，交聯劑為8份。該水凝膠材料 外觀為淺灰色或黑色凝膠體，無肉眼可見之雜質，凝膠pH值為6~8,黏接強度為0.05~ 2.OMPa，平均孔隙率為60~90%，細胞毒性不大于0級。
[0007]具體地，本發明的膠原基貽貝仿生黏附性水凝膠的制備方法如下所述：
[0008] (1)按照常規的"酸-酶結合法"從淡水魚皮或魚鱗中提取未變性淡水魚膠原，經鹽 析、離心、分離、酸溶、透析后冷凍干燥得到海綿狀未變性淡水魚膠原；
[0009] (2)將所提未變性膠原溶于稀酸溶液中，得到一定濃度的膠原溶液，通過低溫調節 pH后，再將配制好的多巴胺溶液按照一定比例加入所述膠原溶液中；
[0010] (3)擇機加入交聯劑，通過調控凝膠化過程、充分水洗、透析、輻照滅菌后即可制備 出膠原基貽貝仿生黏附性水凝膠。
[0011] 上述步驟(1)中所述的淡水魚膠原的原料魚種類涵蓋常見的七大家魚(例如青魚、 草魚、鯉魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚、團頭魴），但不排除其它種類的淡水魚品種。
[0012] 上述步驟(1)中所述的提取未變性淡水魚膠原的"酸-酶結合法"中，酸的種類包括 乙酸、檸檬酸，酸的濃度范圍為〇 . 1~〇 . 5M/L，酶為胃蛋白酶，酶的用量為