第48位保留，Lys63 〇nly，泛素 上所有的賴氨酸都被突變成精氨酸，除了第63位保留）共轉入HEK293T細胞，48h收集細胞 并用8M尿素變性裂解后用鎳珠（beads)配位鍵結合His (即His-pull down實驗），然后用 FLAG及其它相應抗體作免疫印跡分析，結果顯示USP4對ROR γ t的去泛素化作用只針對泛 素上第48位賴氨酸依賴的修飾,而這一特殊位置的泛素化修飾已被證明與蛋白的降解有 關；His-ubi表不將6個His標簽和泛素基因連在一起表達的帶有His標簽的泛素蛋白；
[0089] 圖D.將FLAG-ROR γ t-Jurkat穩轉株用USP4抑制劑（20nM)刺激4小時，及 不刺激和FLAG-Jurkat對照，收集細胞并裂解后用FLAG做免疫共沉淀，然后用內源泛素 (ubiquitin)抗體及其它相應抗體作免疫印跡分析，結果顯示用化學試劑vialinin A抑制 內源的USP4的酶活后會影響ROR γ t的泛素化水平。
[0090] 圖3顯示了 USP4促進ROR Yt誘導的白介素一 17的轉錄和產生，其中，
[0091] 圖A.將IL-17A的熒光素酶啟動子報告基因（一 600 - Obp) ,Renilla (對照）和 不同梯度的HA-USP4與FLAG-ROR γ t共轉入HEK293T細胞，48h收集細胞用熒光素酶報告基 因裂解液裂解后取上清分別加入反應液和阻止液后測熒光值，然后用HA和FLAG及其它相 應抗體作免疫印跡分析，結果顯示USP4對ROR γ t介導的IL-17A的轉錄的促進是USP4梯 度依賴的；
[0092] 圖B，C.將HEK293T細胞轉入USP4的基因敲低質粒（puromycin抗性），換液后于 轉染72小時后加入puromycin篩選一周，將細胞傳代并轉入IL-17A的熒光素酶啟動子報 告基因（一 600 - Obp)，renilla (對照）及FLAG-ROR γ t，48小時后收集細胞進行熒光值 測定和用相應抗體免疫印跡檢測，結果顯示敲低了內源的USP4, ROR γ t介導的IL-17A的轉 錄水平會受到抑制；
[0093] 圖D，E.將IL-17A的熒光素酶啟動子報告基因（一 600 - Obp)，renilla (對照） 共轉入 FLAG-ROR γ t-Jurkat 或 FLAG-Jurkat 細胞，44h 后加入 PMA 和 inomycin (肌霉素） (P/I，模擬TCR信號），4h后收集細胞用熒光素酶報告基因裂解液裂解后取上清分別加入反 應液和阻止液后測熒光值，然后用USP4和FLAG及其它相應抗體作免疫印跡分析，結果顯示 在T細胞穩轉株中，加入USP4酶活抑制劑可以有效的抑制TCR信號通路促進的ROR γ t介 導的IL-17A的轉錄。
[0094] 圖4顯示了 IL-6通過改變USP4的核質定位來促進ROR Y t誘導的白介素一 17的 轉錄和產生，其中
[0095] 圖A.將IL-17A的熒光素酶啟動子報告基因（一 600 - Obp)，renilla (對照）共 轉入FLAG-ROR γ t-Jurkat或FLAG-Jurkat細胞，36h后換新鮮培液加入（P/Ι)過夜，加入 TGFi3 (lng/ml)和IL-6(20ng/ml)刺激8h后收集細胞用熒光素酶報告基因裂解液裂解后取 上清分別加入反應液和阻止液后測熒光值，然后用USP4和FLAG及其它相應抗體作免疫印 跡分析，結果顯示TGF β和IL-6對ROR γ t介導的IL-17A的轉錄的促進作用可以被USP4 的酶活抑制劑（酶活抑制劑（USP4i)為Vialinin A)抵消；
[0096] 圖 B, C.將 FLAG-ROR γ t-Jurkat 或 FLAG-Jurkat 細胞與 USP4 的基因敲低病毒 (puromycin抗性）孵育過夜，換液后于感染72小時后加入puromycin篩選一周，再轉入 IL-17A的熒光素酶啟動子報告基因（一 600 - Obp)，renilla (對照），36h后換新鮮培液 加入（P/Ι)過夜，加入TGFMlng/ml)和IL-6(20ng/ml)刺激8h后收集細胞用熒光素酶報 告基因裂解液裂解后取上清分別加入反應液和阻止液后測熒光值，然后用USP4和FLAG及 其它相應抗體作免疫印跡分析，結果顯示TGF β和IL-6對ROR γ t介導的IL-17A的轉錄的 促進作用可以被USP4的基因敲低抵消；P+I為PMA和Inomycin共同處理，用于模擬TCR信 號通路刺激，PMA翻譯是佛波酯，ionomycin是離子霉素；
[0097] 圖 D.將 FLAG-ROR γ t-Jurkat 細胞加入（P/Ι)過夜，加入 TGFMlng/ml)和 IL-6 (20ng/ml)或同時加 USP4抑制劑刺激8h后收集細胞，裂解后取上清用FLAG做免疫共 沉淀，然后用內源泛素（ubiquitin)抗體及其它相應抗體作免疫印跡分析，結果顯示TGF β 和IL-6對ROR γ t泛素化水平的減少作用可以被USP4的酶活抑制劑抵消；ubi為泛素蛋白 的簡稱；
[0098] 圖E，F.將FLAG-ROR γ t-Jurkat細胞加入（P/Ι)過夜，加入不同處理TGFP (1或 5ng/ml)和IL-6(20ng/ml)刺激8h后收集細胞用多聚甲醛固定30min后，1% BSA封閉Ih 后與USP4相應抗體孵育lh，PBS洗三遍后孵育熒光二抗（紅色），DAPI (藍色）孵育lh，PBS 洗三遍后進行免疫熒光實驗。用藍光（表示細胞核）與紅光（表示細胞核和質中的USP4) 相比的值做柱狀圖表示USP4的核質穿梭比，結果顯示TGF β和IL-6對ROR γ t的影響通過 影響USP4的核定位來起作用（圖中可以看出單加高濃度TGFii或單加 IL-6USP4出核相對 多，同時加入TGFii和IL-6USP4出核減少，增加了細胞核內USP4的含量，促進了去泛素化 酶進入細胞核）。
[0099] 圖5顯示了 USP4抑制劑可以損害Thl7細胞分化并且在Thl7主導的風濕性心臟 病樣本中高表達，其中
[0100] 圖A, B和C.人Na'fve τ細胞經BD FACS Aria II流式細胞分選儀分選后，在Thl7 誘導條件，加入DMSO或USP4抑制劑（luM，2uM，抑制劑（USPi)為Vialinin A)處理7d，收 集細胞后分別進行qRT-PCR和經PE-ROR γ t，APC-F0XP3及Percp/cy5. 5-IL-17抗體染色后 作流式細胞分析，結果顯示在Thl7分化初始以及整個過程中加入USP4的酶活抑制劑可以 很明顯的抑制Thl7的分化效率，原因是ROR γ t的穩定性降低或者是分化過程中F0XP3的 表達水平上升。
[0101] 圖D.風濕性心臟病人和健康對照組的外周血中用磁珠富集⑶4+T細胞，然后用特 定引物進行qRT-PCR分析，結果顯示在風濕性心臟病病人樣本中USP4的上調與IL-17的上 調具有重要相關性，解釋在體內自身免疫病的炎癥條件下，USP4可能作為特異的藥物靶點 用于治療疾病，而其特異的化學抑制劑可以作為治療新藥。
[0102] 圖 6 顯示了去泛素化酶 USP2, USP4, USP12, USP14, USP39 增強 ROR γ t 介導的 1117a 啟動子的轉錄活性，USP2, USP4, USP17能夠有效地去除ROR γ t的泛素化，其中，
[0103] 圖A.將Myc-USPs (表示將MYC標簽和不同USP基因連在一起表達的帶有MYC標 簽的USP，即去泛素化酶蛋白），HA-ROR γ t，1117a啟動子和β -半乳糖苷酶報告基因共轉 人腎上皮細胞ΗΕΚ293Τ細胞，36小時后收獲細胞后通過螢光素酶報告基因實驗觀察去泛素 化酶對ROR Y t介導的轉錄活性的影響；
[0104] 圖B.將Myc-DUBs (表示將MYC標簽和不同DUB基因連在一起表達的帶有MYC標 簽的DUB，即去泛素化酶蛋白），FLAG-ROR γ t和HA-Ubiquitin (表示將HA標簽和泛素基因 連在一起表達的帶有HA標簽的泛素蛋白）共轉入HEK293T細胞，48h收集細胞后經RIPA緩 沖液裂解后以抗Flag抗體作免疫共沉淀，然后用相應抗體作免疫印跡檢測；
[0105] 圖C. 1117a啟動子和β-半乳糖苷酶報告基因，Myc-USP17與Flag-ROR Yt共轉 人腎上皮細胞HEK293T細胞，36小時后收獲細胞后用報告基因裂解液裂解細胞，并加入反 應底物檢測相關活性的影響；
[0106] 圖D.在Flag-RORYt穩轉株中電轉1117a啟動子和Renilla報告基因、 Myc-USP17, 36-48小時后使用PM和Inomycin刺激12小時后收樣，通過雙熒光素酶報告基 因實驗檢測。
[0107] 圖7顯示了 USP17和ROR Yt相互作用，其中
[0108] 圖A. USP17與ROR γ t相互作用，Flag-ROR γ t與Myc-USP17被共轉入六孔板中的 HEK293T細胞中，48小時后收獲細胞，裂解后分別加入1 μ g的抗Flag或抗Myc的單克隆抗 體沉淀，再經抗Myc或抗Flag的單克隆抗體進行免疫印跡分析。細胞裂解液中ROR γ t和 USP17的表達水平也經免疫印跡分析；
[0109] 圖B.將naive T細胞在Thl7誘導條件下誘導7d，然后收集細胞并經RIPA緩沖 液裂解后以USP17抗體作免疫共沉淀，然后用相應抗體作免疫印跡檢測；
[0110] 圖a RORYt結構域示意圖；
[0111] 圖D.USP17可以和RORYt的兩個結構域相互作用。在293Τ細胞中共轉入Flag 標簽的ROR Y t三個截斷突變體和USP17,48小時后收獲細胞，裂解后經抗Myc的單克隆抗 體沉淀，再經抗Myc或抗Flag的單克隆抗體進行免疫印跡分析。細胞裂解液中ROR γ t突 變體和USP17的表達水平也經免疫印跡分析。
[0112] 圖8顯示了 USP17穩定RORYt，其中
[0113] 圖A. USP17增強ROR Y t穩定性，相同劑量的Flag-ROR Y t分別與劑量逐漸增加 的Myc-USP17以及Myc-USP17C89S共轉人腎上皮細胞HEK293T細胞，48小時后收獲細胞，細 胞裂解液中的USP17和ROR γ t表達水平經免疫印跡分析；
[0114] 圖&1^?17穩定1?01^扒延長其半衰期。]\^(3-1^?17與？138-1?01^七共轉人腎上 皮細胞HEK293T細胞，在收獲細胞前用蛋白質合成抑制劑CHX分時段處理（0h，4h，8h，12h)， 細胞裂解液中的USP17和ROR γ t表達水平經免疫印跡分析。
[0115] 圖C.運用Image J圖像分析軟件，對8B不同時段不同處理的ROR Y t蛋白條帶的 強度定量分析。
[0116] 圖9顯示了 USP17去RORYt K48位相關的泛素化，其中
[0117] 圖A. Myc-ROR Y t和Flag-Ubiquitin共轉入293T細胞中，48小時后收獲細胞，收 細胞前蛋白降解抑制劑MG132(20um/ml)處理3h，經抗Myc的單克隆抗體沉淀，再經抗Myc 或抗Flag的單克隆抗體進行免疫印跡分析，細胞裂解液中ROR γ t的表達水平也經免疫印 跡分析；
[0118] 圖 B.在 293T 細胞內轉染 Flag-RORYt，Myc_USP17, Myc_USP17C89S 和 His-Ubiquitin，48小時后收集細胞，收集細胞前MG132 (20um/ml)處理3h，使用Ni-NTA鎳 螯合樹脂純化沉淀，再經抗Myc,抗Flag以及抗His的單克隆抗體進行免疫印跡分析，細胞 裂解液中ROR Y t，泛素和USP17的表達水平也經免疫印跡分析；
[0119] 圖C.USP17能夠去泛素化K48位點相關的泛素，293T細胞內轉染Flag-RORY t， Myc-USP17和His-Ubiquitin突變體K63only和K48only, 48小時后收集細胞，收集細胞前 MG132 (20um/ml)處理3小時，使用Ni-NTA鎳螯合樹脂純化沉淀，再經抗Myc，抗Flag以及 抗His的單克隆抗體進行免疫印跡分析，細胞裂解液中ROR γ t，泛素和USP17的表達水平也 經免疫印跡分析。
[0120] 圖10顯示了11117細胞中下調1^17減少1^^的蛋白水平并影響11117相關細 胞因子的轉錄水平，其中，
[0121] 圖A.在293T細胞中同時外轉Myc-USP17和USP17的特異性shRNA，48小時后收 集細胞，裂解后通過抗Myc單克隆抗體行免疫印跡分析，檢測shRNA敲除效率；
[0122] 圖B. DR8. 9, shRNA, VSVG三質粒系統包裝慢病毒，36-48小時后收集病毒，感染 Flag-ROR γ t穩轉株細胞，因構建shRNA攜帶puromycin抗性，故用puromycin篩選一周后， 收細胞裂解后用抗ROR Y t、抗USP17抗體行免疫印跡檢測相關蛋白的表達；
[0123] 圖C. DR8. 9, shRNA, VSVG三質粒系統包裝慢病毒，36-48小時后收集病毒，感染體 外誘導分化好的Thl7細胞，因構建shRNA攜帶puromycin抗性，故用puromycin篩選一周 后，收細胞裂解后用抗ROR Y t抗體、抗USP17抗體行免疫印跡檢測相關蛋白的表達；
[0124] 圖D. puromycin篩選一周后的Thl7細胞抽提RNA并反轉cDNA，使用實時定量PCR 的方法檢測相關基因（USP17, IL-17A，IL-17F，IL-23R)的轉錄水平。
[0125] 圖11顯示了 USP17轉錄水平在系統性紅斑狼瘡病人（SLE)中明顯升高，其中，
[0126] 圖A.抽取符合系統性紅斑狼瘡診斷標準病人和健康對照組外周靜脈血，使用 ⑶4+T細胞富集試劑盒分離⑶4 +T細胞后抽提RNA并反轉cDNA，通過實時定量PCR檢測相關 基因；
[0127] 圖B.對USP17與IL-17A及IL-17F的轉錄水平進行相關性分析；
[0128] 圖C.根據SLE患者疾病活動度指數將病人分組，分析比較活動組和非活動組 USP17轉錄水平的變化。
【具體實施方式】
[0129] 本發明人通過廣泛而深入的研究，意外的發現，去泛素化酶對于上調RORYt的穩 定性具有顯著影響，進而能夠上調輔助性T細胞活性及其分化并且能夠上調輔助性T細胞 細胞因子的表達，在此基礎上完成了本發明。
[0130] 術語
[0131] 去泛素化酶及其制備方法
[0132] 迄今為止已經發現大約100種去泛素化酶，主要功能是通過水解泛素上羧基末 端殘基，將泛素分子從連接有泛素的蛋白上水解下來。根據其結構和功能特點可分為五 個家族：泛素羧基末端水解酶家族（Ubiquitin C-terminal hydrolases, UCHs)、泛素特 異性水解酶家族（Ubiquitin-specific proteases, USPs)、卵巢腫瘤相關蛋白酶（Ovarian tumor，0TU)、Ataxin_3(含 Josephin 結構域）、MPN(+)/JAMM 蛋白酶（JABl/MPN/Mov34 metlloenzyme domain zinc-dependent metalloprotease family)〇
[0133] 目前發現去泛素化酶功能包括：①去泛素化酶通過共同翻譯的方式激活泛素前蛋 白。泛素作為一個前蛋白表達并融合到核糖體蛋白或線性多聚泛素上，同時多聚泛素基因 產物也必須去除碳端多余的殘基才能活化泛素。②去泛素化可回收被包含巰基酯中間體的 小細胞親核試劑捕獲的泛素，從而參與蛋白的泛素化。③去泛素化酶反向去除靶蛋白的泛 素化或泛素樣修飾。去泛素化酶拮抗蛋白的泛素化，類似于激酶/磷酸酶調節通路中磷酸 酶的作用。④去泛素酶負責來自非錨定多聚泛素鏈上單泛素的再生。
[0134] 去泛素化酶USP4專門去除底物蛋白的單聚或者多聚泛素化并阻止其進入蛋白酶 體降解或者影響其發揮功能，從而影響腫瘤發生，細胞凋亡，免疫反應等活動。研究發現 USP4可以通過靶作用與抑癌基因 P53從而促進腫瘤發展，也可以通過穩定腫瘤生長因子 受體（TGFPRl)來促進腫瘤的生長。但是，USP4對免疫系統的影響仍然不清楚。
[0135] 而去泛素化酶USP17通過HABM結構域與SDS相互作用從而抑制腫瘤細胞生長。最 近發現USP17能夠通過對RIG-I和MDA5的去泛素化調節病毒誘導的I型干擾素信號。USP17 缺失阻止了正常細胞骨架的重排和趨化因子誘導的Rho GTP酶膜定位，因此，在正常細胞運 動過程中USP17對于Rho GTP酶的定位也是必不可少的。總之，USP17對細胞凋亡、細胞增 殖、細胞周期進程的影響是維持細胞穩態的重要因素。風濕性心臟病是由于感染了鏈球菌， 鏈球菌細胞壁上有一種成份與人心瓣膜等結締組織的成份相似，進而發展成免疫自身從而 破壞心臟瓣膜的疾病，另外系統性紅斑狼瘡也是一種臨床常見的自身免疫性疾病，臨床表 現復雜多變，病情遷延難愈，目前治療的策略尚匱乏