泛素化途徑相關因子在調控輔助性t細胞功能中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物和生物醫藥領域。更具體而言，本發明涉及泛泛素化途徑相 關因子在調控輔助性T細胞功能中的應用。
【背景技術】
[0002] 輔助性Thl7細胞是新發現的在免疫系統中具有促進炎癥反應的CD4陽性的效應 性T細胞亞群。它們通過產生細胞因子白介素-17 (IL-17)，參與T細胞免疫反應，協調機體 對特定病原體的防衛，同時調控組織炎性反應，在感染性疾病、自身免疫性和移植排斥中發 揮重要的作用。孤核受體RORgammat (RORyt)對輔助性Thl7的分化和功能十分重要，是其 細胞分化的特異性轉錄調控因子，又可通過誘導IL-17的分泌調控Thl7炎癥反應。
[0003] 目前的研究表明腫瘤生長因子TGF-β和白介素-6(IL-6)對Thl7的分化是必須 的，同時也需要白介素 Ibeta(IL-Ibeta)和白介素-23(IL-23)。促炎性Thl7細胞的過度 活化是很多炎癥及自體免疫疾病發展的一個關鍵因素。目前關于Thl7細胞的調控有不少 報道，腫瘤壞死因子受體相關因子3 (TRAF3)家族可以通過靶作用于IL-17受體進而負調控 IL-17的產生，TRAF6則抑制Thl7的分化。
[0004] 本領域技術人員一直致力于開發調節免疫系統活性的技術，用于治療免疫反應失 調所引起的疾病。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種泛素化途徑相關因子在調控輔助性T細胞功能中的 應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供了去泛素化酶或者去泛素化酶激動劑的用途，用于制備 制劑或試劑盒，所述制劑或試劑盒用于：
[0007] (1)增加 ROR Y t的穩定性；和/或
[0008] (2)上調輔助性T細胞活性或促進輔助性T細胞的分化；和/或
[0009] (3)調節輔助性T細胞細胞因子的表達或活性；和/或 [0010] ⑷治療和/或預防與輔助性T細胞活性過低相關的疾病。
[0011] 在另一優選例中，所述的輔助性T細胞活性過低是指輔助性T細胞促炎癥功能過 低。
[0012] 在另一優選例中，所述的與輔助性T細胞活性過低相關的疾病選自：腫瘤和傳染 性疾病。
[0013] 在另一優選例中，所述腫瘤選自：前列腺癌、乳腺癌、肝癌、膠質瘤、腸癌、子宮頸 癌、非小細胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮膚癌、橫紋肌癌、舌鱗癌、鼻咽癌、卵巢癌、 胎盤絨毛癌、神經膠質瘤、淋巴瘤、白血病、直腸腺癌或黑色素瘤。
[0014] 在另一優選例中，所述傳染性疾病選自：鼠疫、霍亂、傳染性非典型肺炎、艾滋病、 病毒性肝炎、脊髓灰質炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙 型腦炎、手足口病、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、流行性腦 脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血 吸蟲病、瘧疾、流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結膜炎、麻風病、流行性和地方 性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外 的感染性腹瀉病、或真菌感染。
[0015] 在另一優選例中，所述去泛素化酶選自下組中的一種或多種：USPs家族 (Ubiquitin-specific proteases, USPs)和 OUT 家族。
[0016] 在另一優選例中，所述去泛素化酶選自下組中的一種或多種：USP2、USP3、USP4、 USP5、USP7、USP10、USP12、USP14、USP17、USP18、USP21、USP22、USP30、USP39、USP44、Y0D1、 CYLD和A20 ;優選地，所述去泛素化酶為USP2、USP4、USP17或其組合。
[0017] 在另一優選例中，所述輔助性T細胞選自下組中的一種或多種：Thl、Th2、Th3、 Th9、Thl7 和 Tfh。
[0018] 在另一優選例中，所述輔助性T細胞細胞因子選自下組中的一種或多種：F0XP3、 IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-23R 和 IL-2。
[0019] 在另一優選例中，所述"調節輔助性T細胞細胞因子的表達或活性"是指：
[0020] 下調選自下組中的一種或多種輔助性T細胞細胞因子的表達或活性：IL_17A、 IL-17F、IL-21、IL-23R 和 / 或 IL-2 ;和 / 或
[0021] 上調F0XP3的表達或活性。
[0022] 在另一優選例中，所述去泛素化酶激動劑選自下組中的一種或多種：去泛素化酶 進核促進劑和/或炎性細胞因子，優選地，所述炎性細胞因子為TGF-β。
[0023] 在另一優選例中，所述去泛素化酶進核促進劑是指，促進去泛素化酶進入細胞核 的物質或使細胞核中泛素化酶含量增加的物質（如IL6)。
[0024] 在另一優選例中，所述增加 ROR Y t的穩定性是通過以下方式實現：對ROR Y t進行 去泛素化。
[0025] 在另一優選例中，所述去泛素化選自：R0R Y t K48位點的去泛素化。
[0026] 在另一優選例中，所述去泛素化酶源自哺乳動物（選自：人）。
[0027] 在另一優選例中，所述USP4的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示；
[0028] 所述USP17的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 4所示；和/或
[0029] 所述USP2的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 6所示。
[0030] 在另一優選例中，所述的去泛素化酶選自：野生型或突變型的去泛素化酶，也選 自：具有與野生型去泛素化酶具有相同功能的去泛素化酶的活性片段或去泛素化酶的衍生 物。
[0031] 在另一優選例中，所述去泛素化酶的衍生物選自：經修飾的去泛素化酶分子、氨基 酸序列與天然去泛素化酶同源且具有天然去泛素化酶活性的蛋白分子、去泛素化酶的二聚 體或多聚體、含有去泛素化酶氨基酸序列的融合蛋白。
[0032] 在另一優選例中，所述經修飾的去泛素化酶是PEG化的去泛素化酶。
[0033] 在另一優選例中，所述"氨基酸序列與天然去泛素化酶同源且具有天然去泛素化 酶活性的蛋白分子"是指其氨基酸序列與野生型氨基酸序列相比（如對于USP4而言，與SEQ ID NO. :2相比），具有彡85%的同源性，較佳地彡90%的同源性，更佳地彡95%的同源性， 最佳地> 98%同源性；并且具有天然去泛素化酶活性的蛋白分子。
[0034] 在另一優選例中，所述與輔助性T細胞活性相關的疾病是指與輔助性T細胞活性 過1?或過低相關的疾病或癥狀。
[0035] 在另一優選例中，所述與輔助性T細胞活性相關的疾病選自：腫瘤、炎癥反應、或 自身免疫性疾病。
[0036] 在另一優選例中，所述的制劑選自：藥物組合物、保健品組合物、食品組合物、疫 苗組合物或實驗試劑。
[0037] 本發明的第二方面，提供了去泛素化酶拮抗劑的用途，用于制備制劑或試劑盒，所 述制劑或試劑盒用于：
[0038] (1)降低ROR Y t的穩定性；和/或
[0039] (2)下調輔助性T細胞活性或抑制輔助性T細胞的分化；和/或
[0040] (3)調節輔助性T細胞細胞因子的表達或活性；和/或
[0041] (4)治療和/或預防與輔助性T細胞活性過高相關的疾病；和/或
[0042] (5)上調F0XP3的表達，增強Treg的免疫抑制功能；和/或
[0043] (6)治療和/或預防與調節性T細胞活性相關的疾病。
[0044] 在另一優選例中，所述"調節輔助性T細胞細胞因子的表達或活性"是指：
[0045] 上調選自下組中的一種或多種輔助性T細胞細胞因子的表達或活性：IL_17A、 IL-17F、IL-21、IL-23R 和 / 或 IL-2 ;和 / 或
[0046] 下調F0XP3的表達或活性。
[0047] 在另一優選例中，所述的與輔助性T細胞活性過高相關的疾病選自下組：炎癥反 應和自身免疫性疾病。
[0048] 在另一優選例中，所述炎癥反應選自：過敏性炎癥、毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、肝炎、 腎炎、痤瘡、哮喘、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、超敏反應、炎性腸道疾病、盆腔炎、 再灌注損傷、血管炎或間質性膀胱炎。
[0049] 在另一優選例中，所述自身免疫性疾病選自：多發性硬化癥、風濕性關節炎、類風 濕關節炎、風濕性心臟病、器官移植中的排異反應、系統性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結 腸炎、強直性脊柱炎、自身免疫性腦脊髓炎等自身免疫病，優選潰瘍性結腸炎和自身免疫性 腦脊髓炎。
[0050] 在另一優選例中，所述去泛素化酶措抗劑選自：抗體、sh-RNA、miRNA、反義寡核苷 酸、化學抑制劑或其組合。
[0051] 在另一優選例中，所述拮抗劑選自：抗USP4抗體、抗USP17抗體、shUSP4(短發夾 RNA)、shUSP17 (短發夾RNA)、針對USP4或USP17的反義寡核苷酸、USP4或USP17的化學抑 制劑。
[0052] 在另一優選例中，所述的shUSP17的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 16所示。
[0053] 在另一優選例中，所述化學抑制劑為：4,4 "，5'，6'_四羥基[1，Γ :4'，1"_三聯 苯]-2'，3'-二基酯苯乙酸（Vialinin A) 〇
[0054] 在另一優選例中，所述調節性T細胞選自：自然調節性T細胞（nTreg)和誘導產生 的適應性調節性T細胞（iTreg)。
[0055] 在另一優選例中，所述與調節性T細胞活性相關的疾病選自下組：癌癥，病毒感 染，自身免疫病，優選自身免疫性疾病。
[0056] 本發明的第三方面，提供了一種用于增加 ROR Y t的穩定性的組合物，所述組合物 選自：去泛素化酶或其衍生物，和/或去泛素化酶激動劑。
[0057] 在另一優選例中，所述去泛素化酶激動劑如上所述。
[0058] 在另一優選例中，所述組合物還含有藥學上可接受的載體。
[0059] 在另一優選例中，所述組合物的劑型選自：固態制劑、液態制劑，較佳地為干粉或 溶液形式。
[0060] 在另一優選例中，所述的組合物為藥物組合物、保健品組合物或疫苗組合物。
[0061] 本發明的第四方面，提供了一種分離的復合物，所述復合物為去泛素化酶和 ROR Y t相結合所形成的復合物。
[0062] 在另一優選例中，所述復合物為二元復合物。
[0063] 在另一優選例中，所述復合物的分子量3 80KD;優選地所述復合物的分子量 彡 IOOKD0
[0064] 在另一優選例中，所述復合物的分子量為100KD-500KD ;優選地為100KD-200KD。
[0065] 本發明的第五方面，提供了本發明第四方面所述的復合物的應用，用于篩選藥物 或化合物，所述藥物或化合物促進或抑制去泛素化酶和ROR Y t形成所述的復合物。
[0066] 在另一優選例中，當應用所述復合物篩選藥物時，所述應用包括步驟：
[0067] (a)在測試組中，在待測物質存在下，培養輔助性T細胞，并且設置無待測物質的 對照組；
[0068] (b)檢測測試組中所述復合物的含量Hl并與對照組中的復合物含量HO進行比較， 其中當Hl顯著高于H0,則表示所述測試物為去泛素化酶的促進劑；當Hl顯著低于H0,則表 示所述測試物為去泛素化酶的拮抗劑。
[0069] 在另一優選例中，當應用所述復合物篩選藥物時，所述應用包括步驟：
[0070] (a)在測試組中，將待測物質與（a)所述復合物和/或（b)去泛素化酶和ROR Y t 進行共孵育；并且設置無待測物質的對照組；
[0071] (b)檢測測試組中所述復合物的含量Hl并與對照組中的復合物含量HO進行比較， 其中當Hl顯著高于H0,則表示所述測試物為去泛素化酶的促進劑；當Hl顯著低于H0,則表 示所述測試物為去泛素化酶的拮抗劑。
[0072] 本發明的第六方面，提供了一種去泛素化酶拮抗劑的用途，用于制備治療系統性 紅斑狼瘡或風濕性心臟病的藥物。
[0073] 在另一優選例中，所述去泛素化酶措抗劑選自：抗體、sh-RNA、miRNA、反義寡核苷 酸、化學抑制劑或其組合。
[0074] 在另一優選例中，所述拮抗劑選自：抗USP4抗體、抗USP17抗體、shUSP4(短發夾 RNA)、shUSP17 (短發夾RNA)、針對USP4或USP17的反義寡核苷酸、USP4或USP17的化學抑 制劑。
[0075] 在另一優選例中，所述的shUSP17的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 16所示。
[0076] 在另一優選例中，所述化學抑制劑為：4,4 "，5'，6'_四羥基[1，Γ 三聯 苯]-2'，3'-二基酯苯乙酸（Vialinin Α) 〇
[0077] 本發明的第七方面，提供了含有選自下組中一種或兩種組分的組合物在制備促進 去泛素化酶進入細胞核的試劑中的用途：IL-6和TGF β。
[0078] 在另一優選例中，所述去泛素化酶選自下組中的一種或多種：USPs家族 (Ubiquitin-specific proteases, USPs)和 OUT 家族。
[0079] 在另一優選例中，所述去泛素化酶選自下組中的一種或多種：USP2、USP3、USP4、 USP5、USP7、USP10、USP12、USP14、USP17、USP18、USP21、USP22、USP30、USP39、USP44、Y0D1、 CYLD和A20 ;優選地，所述去泛素化酶為USP2、USP4、USP17或其組合。
[0080] 在另一優選例中，所述促進去泛素化酶進入細胞核的試劑包括促進去泛素化酶進 入細胞核的試劑和/或使細胞核中泛素化酶含量增加的試劑。
[0081] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0082] 圖1顯示了 USP4在Thl7中高表達，并影響其重要轉錄因子ROR Y t的穩定性。
[0083] 圖1A，圖1B.用流式細胞技術（FACS)從人外周血細胞（PBMC)中分選出 CD45RA+CD4+naive T細胞，在不同的輔助性T細胞誘導條件下得到不同的輔助性T細 胞亞群和誘導型調節性T細胞（iTreg)，抽提RNA進行用特異的引物實時熒光定量 PCR(q-RTPCR)或者用特異的抗體蛋白免疫印跡實驗（WB)，結果顯示USP4在Thl7中高表 達。圖中，shCK為基因的表達沒有有影響的對照，shUSP4-l和shUSP4-2分別為USP4基因 被特異敲低的實驗組。
[0084] 圖1C，圖1D.將naive T細胞在Thl7誘導條件下誘導7d，與USP4的基因敲低病 毒（puromycin抗性）孵育過夜，換液后于感染72小時后加入puromycin篩選一周，收集細 胞進行q-RTPCR和用相應抗體免疫印跡檢測，結果顯示敲低USP4可以影響ROR Y t蛋白水 平的穩定性，但是對其mRNA水平沒有影響，說明USP4對ROR γ t的調節可能為翻譯后修飾 水平。
[0085] 圖2顯示了 USP4通過結合和去泛素化作用影響ROR Y t的穩定性，其中，
[0086] 圖A.將naive T細胞在Thl7誘導條件下誘導7d，然后收集細胞并經RIPA緩沖 液裂解后以USP4抗體作免疫共沉淀，然后用相應抗體作免疫印跡檢測，結果顯示USP4和 ROR Y t在Thl7中可以直接相互作用；IP-USP4表示用USP4的特異識別抗體在細胞裂解液 中對USP4蛋白進行富集，INPUT表示沒有經過處理的細胞裂解液的上清，下同；
[0087] 圖將HA-USP4或其酶活缺失突變Ser31IA突變體與FLAG-ROR γ t共轉入 HEK293T細胞，36h后分別用抑制蛋白合成試劑（CHX(Cycloheximide from microbial)放 線菌酮）處理細胞〇, 4, 8, 12h，然后收集細胞并裂解后用HA和FLAG及其它相應抗體作免 疫印跡分析，結果顯示野生型USP4可以很好的延長ROR Y t蛋白的半衰期，但是酶活突變體 作用很弱；HA-USP4表示將HA標簽和USP4基因連在一起表達的帶有HA標簽的USP4蛋白， FLAG-ROR γ t表示將FLAG標簽和ROR γ t基因連在一起表達的帶有FLAG標簽的ROR γ t蛋 白，WT表示野生型，CA表示USP4的酶活相關位點即氨基酸序列上的第311位的半胱氨酸 被突變成了丙氨酸，其蛋白構向和疏水性均發生改變因而酶活降低，下同；
[0088] 圖 C.將 HA-USP4 與 FLAG-RORyt 及 His-泛素（ubiquitin)或其突變體 (Lys48〇nly，泛素上所有的賴氨酸都被突變成精氨酸，除了