oire)，這是因為在自性細胞中誘導的溶酶體介導的抗 原加工活動。
[0126] 由經IFN-γ處理的細胞系所產生的非凋亡性的、自噬性腫瘤細胞可以與樹突細 胞整合，以增強抗原呈遞，這是因為在自噬性腫瘤細胞的表面上高水平的主要組織相容性 復合體。該過程會得到由兩種細胞類型融合而產生的新的細胞產物。
[0127] 對IFN-γ的應答時誘導自噬的過程可以以不導致細胞凋亡的方式誘導。通過用 半胱天冬酶抑制劑和干擾素-γ合并處理腫瘤細胞，可以阻斷細胞死亡（并最終阻斷耐受 性凋亡細胞的形成）的過程，而不抑制自噬的誘導或主要組織相容性II類復合體的增加。
[0128] 消除凋亡細胞同時保留有活力的自噬性細胞的程序
[0129] 黑色素瘤的研究表明在臨床試驗中凋亡細胞的存在與差生存率之間具有相關性 (Cornforth等（2011)Cancer Immunol. Immunother. 60 :123-131 ;Dillman等（2011)Cancer Biother. Radiopharmaceuticals 26:407-415)。下面研究調查了在體外 IFN-γ 處理黑色 素瘤腫瘤細胞后自噬的誘導、細胞凋亡和MHC II類分子。
[0130] 過濾
[0131] 下面提供"過濾"程序。本發明提供方法以及通過這些方法所產生的細胞，其用于 增強非凋亡性細胞中黑色素瘤細胞群落。在體外IFN-γ處理之前，在任意給定的黑色素瘤 細胞群落中，第一百分數細胞可以偏向于是凋亡性的，并且第二百分數細胞可以偏向于是 非凋亡性的。在本發明上下文中，偏向指的是體外IFN-γ處理刺激第一百分數細胞（或第 一子群落細胞）的細胞凋亡，但不刺激第二百分數細胞（或第二子群落細胞）的細胞凋亡。 在多個實施方式中，可以使用體外IFN-γ處理來富集用于樹突細胞疫苗中的黑色素瘤細 胞的免疫學刺激群落，通過迫使偏向于凋亡性的黑色素瘤細胞經歷細胞凋亡。一旦偏向于 凋亡性的黑色素瘤細胞的子群落經歷細胞凋亡，就可以將這些細胞去除并丟棄。
[0132] 本項研究的方法如下。在測定自噬、細胞凋亡和MHC II類表達之前，用1000IU/mL 的IFN-γ培育自體黑色素瘤腫瘤細胞系和模型黑色素瘤腫瘤細胞系72小時。通過采用對 LC3II的抗體的免疫印跡并通過采用Enzc/ s CytolD?自噬檢測試劑盒的流式細胞法，來 檢測自噬。通過使用7-AAD和Annexin-V染色和對MHC II類的抗體的流式細胞法，分別測 定細胞凋亡和MHC II類誘導。
[0133] 本研究的結果證明IFN-γ既誘導黑色素瘤細胞系中自噬性細胞群落又誘導凋 亡性的細胞群落。凋亡性的群落主要發現于非粘附群落中，而自噬性細胞保持粘附到燒 瓶上。用抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA)阻斷自噬會抑制對IFN-γ應答時MHC II類陽性 細胞的誘導（39. 4% IFN-γ vs. 10. 0% IFN-y+3-MA)。用泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD抑 制半胱天冬酶活性來在經IFN-γ處理的細胞中防止細胞凋亡但不干擾自噬（2. 75±0. 15 IFN- γ vs. 3. 04±0. 27 IFN- γ +Z-VAD，倍數變化）。綜上所述，細胞凋亡的誘導與低水平的 自噬和MHC II類誘導有關。本發明提供消除凋亡性的細胞同時保護有活力的自噬性細胞 的方法或程序以及IFN-γ處理能夠增強這類基于細胞的免疫治療的有效性。
[0134] 第一研究的材料和方法
[0135] 自體樹突細胞生成
[0136] 通過如前所述的塑料粘附法（Choi 等（1998)Clin. Cancer Res. 4 :2709-2716 ; Luft等（1998) Exp. Hematol. 26 :489-500)，生成樹突細胞。簡言之，將自體采血術產物進行 ficoll_hypaque(GE Healthcare，Buckinghamshire，United Kingdom)密度梯度分離。將所 得到的外周血單核細胞置于無抗生素的AIM-V培養基中（Invitrogen，Grand Island，NY)， 上述培養基補充有在以15X106cells/mL的細胞培養瓶（Corning_Costar，Corning，NY)中 各 1000IU/mL 的 IL_4(CellGenix， Freisberg， Germany)和 GM_CSF(Beriex， Seattle， WA) (DC培養基）。培育一小時后，丟棄未粘附群落，并將新鮮DC培養基加入到燒瓶中。第二天 早晨，丟棄未粘附細胞，用室溫PBS將燒瓶洗滌一次，并加入新鮮DC培養基。然后將燒瓶培 養6天，在這段時間進行流式細胞評估來測定該方法（負載DC之前）所產生的DC的百分 數和表型。
[0137] 自體腫瘤細胞系生成
[0138] 將先前報道的生成和表征的純腫瘤細胞擴展到2億個細胞，然后在15% FBS/ ECS 中在 RPMI (完全培養基）中用 1000IU/mL 的 IFN-γ (InterMune，Brisbane，CA)培育 72 小時，用來自銫源的 lOOGy 輻照并凍存（Choi (1998)Clin. Cancer Res. 4 :2709-2716 ; Luft(1998)Exp. Hematol. 26 :489-500 ；Dillman (1993)J.Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14 :65-69)，如前所述。從凍存中恢復經IFN-γ處理且輻照的腫瘤細胞，用PBS洗 滌3次，然后加入體外培養的DC，并培育約24小時。通過用橡皮淀帚輕輕刮取來收獲負載 了抗原的DC，并以相等的量在9-11個等份中凍存。獲得細胞的等分部分，用于流式細胞評 價，其代表負載后的DC細胞。
[0139] 流式細胞法
[0140] 使用對從BD Pharmingen San Diego，CA獲得的表面標志物的單克隆抗體：結合 PerCp的MHC II類抗體、結合APC的⑶11c抗體，⑶80抗體、⑶83抗體、結合PE的⑶86 抗體，進行樹突細胞群落的表型表征。使用同型對照來測定百分陽性細胞。使用來自BD Pharmingen的對結合FITC的MHC I和II類的抗體、Annexin-V-PE和7-氨基放線菌素 D (7-AAD)，進行腫瘤細胞的流式細胞法。在每個批次之前，使用CaliBRITE流式細胞校準 (BD Pharmingen)，并且在流式細胞數據的整個收集過程中使用相同的儀器設定。
[0141] 免疫印跡測定
[0142] 用 Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)加蛋白酶抑制劑混合物（Roche，Indianapolis，IN)以10, 000細胞/uL在冰上，制備 細胞質的細胞裂解物。將大約25uLs/道的細胞裂解物在12. 5 % Tris-甘氨酸凝膠上分 離，轉移到PVDF膜，并用針對如下的抗體進行探測：鈣網蛋白（MBL，Woburn，MA)、Hsp-60、 Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems，Minneapolis，MN)、HMBG-1 (Cell Signaling，Danvers，ΜΑ)、 I CAM-1 (Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、Mel_4、Mart-1 (Signet，Emeryville，CA)、 酪氨酸酶（Upstate，Lake Placid，NY)和 GADPH(Calbiochem，Darmstadt，Germany)。
[0143] 免疫組織化學
[0144] 使用免疫細胞化學程序，測定黑色素瘤系對一組（panel)抗原的表達。在存在或 不存在1000IU/mL IFN-γ的情況下，在8室培養載玻片（Thermo Fisher，Rochester，NY)中 培養細胞。72小時后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)洗滌3次，并固定在冷丙酮中。阻斷內源性 過氧化物酶后，用適當的對所列抗原的一抗（primary antibodies)培育細胞。使用生物素 化抗鼠（anitmouse)或兔免疫球蛋白、結合超敏感酶的鏈霉親和素標記（Super Sensitive enzyme-conjugated streptavidin labeling)和辣根過氧化物酶色原體（chromogen)以及 底物試劑盒（Biogenex，San Ramon，CA)，進行免疫組織化學。采用同型匹配對照抗體，研究 如下抗人多克隆或單克隆抗體的活性：S-100和HMB-45 (Biogenex，San Ramon，CA)、Mel_2、 Mel_5、art-1 (Signet，Dedham，MA)、酪氨酸酶和 Mage-1 (Thermo Scientific，Fremont，CA)、 Melan-A、HLA-I 類和 HLA-II 類（Dako, Denmark)。
[0145] 統計分析
[0146] 在雙尾檢驗的學生t檢驗中，兩樣本的方差相等。通過p值< 0. 05確定顯著差異。
[0147] 第一研究的結果
[0148] 在完全培養基中，對用IFN-γ培育72小時應答時，在自體黑色素瘤腫瘤細胞系中 差異地引起細胞死亡。在經IFN-γ處理的細胞上或者未經IFN-γ處理的細胞上，進行臺 盼藍拒染料測定，其表明在經IFN-γ處理的細胞中向更低活力的顯著趨勢（89. 1±6. 8% vs. 84. 9±9. 3%，p = 0. 014，N = 47)。通過流式細胞法分析四個自體黑色素瘤細胞系的樣 本的細胞凋亡誘導（圖1A)，其表明黑色素瘤細胞對IFN- γ誘導的細胞凋亡差異地敏感，其 中一些細胞顯示更遲的細胞凋亡或"死亡"群落（7-AAD+/Annexin-V+)，而其他細胞顯示出 更早的細胞凋亡或"即將死亡"群落（7-AAD-/Annexin-V+)的信號。IFN-γ處理后所得到 的凋亡性細胞的存在與無進展生存期和總生存期中顯著降低有關（Comforth (2010) Cancer Immunol. Immunother. Resistance to the proapoptotic effects of interferon-gamma on melanoma cells used in patient-specific dendritic cell immunotherapy is associated with improved overall survival) 〇 對數秩檢驗（log-rank test)表明 iFN_Y處理黑色素瘤腫瘤細胞后較低的活力與所研究患者中總生存期明顯相關。
[0149] 將在存在或不存在IFN-γ的情況下發育的細胞裂解物進行各種分子的免疫印 跡，這些分子可能是免疫的重要介導物（圖1B)。在用IFN-γ處理的黑色素瘤細胞的設定 中，熱休克蛋白似乎被差異性地調控，但基本上仍存在于細胞制劑中，尤其是在hsp-70的 情況下。內質網蛋白、鈣網蛋白和高迀移率族蛋白l(HMGB-l)似乎在某些情況下IFN-γ處 理后被正調節（圖1B)。相反，普通黑色素瘤抗原（mel-4、Mart-Ι和酪氨酸酶）通常似乎 被IFN-γ負調節，而ICAM-1被顯著正調節（圖1C)，ICAM-1是一種與對淋巴細胞介導的細 胞毒性的敏感度有關的淋巴細胞黏附分子（Hamai (2008) Cancer Res. 68:9854-9864)。事 實上發現，經IFN-γ處理的黑色素瘤腫瘤細胞對細胞毒性T淋巴細胞（CTL)活性更敏感。 此外，一組黑色素瘤相關抗原的免疫組織化學表明，IFN-γ導致在許多考查的抗原中抗原 表達的負調節（表1)。
[0150] IFN-γ的使用導致主要組織相容性復合體I類和II類的正調節（Bohn (1998) J. Immunol. 161 :897-908)。如圖ID中所示，用IFN-γ處理自體黑色素瘤細胞導致幾乎普 遍的且顯著的MHC I類正調節（p = 2. 8X10 8)，中值倍數誘導（median fold induction) 為2. 91 ±1.13 (95% C. I.)。此外，MHC II類的平均熒光強度也顯著較高，但稍遜色（p = 0.039)，中值誘導為4. 23±2. 66(95% C.I.)。在自體黑色素瘤細胞表面上MHC II類分子 的水平通常低于MHC I類分子，但在70%的情況下，對IFN-γ處理應答時對于MHC II類分 子來說誘導高2倍，這是因為MHC II類表達的低初始水平。在抗原負載到樹突細胞上時， 腫瘤細胞上這些分子的存在可以提供將MHC復合體"易裝"（"cross dressing"）到抗原呈 遞細胞上的機會（Dolan (2006) J. Immunol. 277 :6018-6024, Dolan (2006) J. Immunol. 176 : 1447-1455)。
[0151] 用IFN-γ培育一組四個代表性自體黑色素瘤細胞系，并等量負載到樹突細胞上， 然后通過流式細胞法測定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II類的表達。結果表明，在負載經IFN- γ 處理的黑色素瘤細胞后，觀察到表達CD83的樹突細胞的陽性群落百分數的小幅但明顯增 加（圖2)。此外，在⑶86散點圖（左上象限）中標出更多的未經處理的腫瘤細胞，結果是 CD86陽性群落百分數明顯減少，表明未經IFN-γ處理的腫瘤細胞仍然存在。此效果最可能 地是由于IFN-γ誘導細胞凋亡，因為凋亡性細胞更可能被之前報告的樹突細胞吞噬。
[0152] 如圖3中所示，負載前DC的樣本表明其表達CD80 (39. 0± 16. 2 % )、 CD83(7. 1±6.9%)、CD86(73.6±19.5%)并且是MHC II 類陽性的，并且具有 96·2±5·0% 活力。負載的DC具有顯著更高百分數的⑶83(9. 4±7. 1%，ρ = 0.019)和顯著更高的平均 熒光強度（172. 9±79.0，ρ = 0.0009)，表明用經輻照的、IFN-γ處理的腫瘤細胞負載DC在 一些樹突細胞中誘導成熟（圖3B)。
[0153] 第一研究討論
[0154] 在抗腫瘤免疫的上下文中，抗原負載、成熟和施用的方案以及在基于樹突 細胞（DC)的免疫治療的指導是本領域技術人員已知的。這種類型的治療包含經純 化的自體腫瘤細胞作用抗原的來源的用途，并且包含與腫瘤相關抗原的患者特異庫 (repertoire) (Selvan(2010)Melanoma Res. 20 :280-292 ；Diliman(2007)Cancer Biother. Radiopharm. 22 :309-321)。一些臨床試驗使用未純化的自體實體（bulk)腫瘤。這種抗 原來源可能具有已污染的成纖維細胞和壞死組織（〇' R〇urke(2007)Melanoma Res.17: 316-322)。與腫瘤干細胞有關的抗原可以存在于經純化的細胞系中（Dillman(2006)New Engl.J.Med. 355:1179-1181)。IFN-γ 處理提高 MHC II 類分子的表達。MHC II 類分子 對于對基于樹突細胞的治療的應答非常重要。存在于吞噬物質中的分子（諸如鈣網蛋 白、