具有γ干擾素的抗原呈遞癌癥疫苗的制作方法
【專利說明】具有Y干擾素的抗原呈遞癌癥疫苗
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2012年10月22日，申請號為 201280051821. 7(PCT/US2012/061294)，發明名稱為"具有γ干擾素的抗原呈遞癌癥疫 苗"。
[0002] 相關申請
[0003] 本申請要求享有2011年10月20日提交的美國臨時申請No. 61/549681和2012 年2月2日提交的美國臨時申請No. 61/594304的全部巴黎公約優先權及其權益，上述兩篇 臨時申請通過引用并入本文，如同其全部內容在本文中闡述一樣。
技術領域
[0004] 本發明涉及治療黑色素瘤、篩選適合治療的受試者、物質組合物、方法和試劑盒。
[0005] 發明背景
[0006] 癌癥的特征是缺乏對癌癥有效的免疫應答。免疫應答的缺乏可由以下事實引起： 例如許多腫瘤抗原是"自身抗原";腫瘤細胞缺乏MHC的表達以及由此產生的腫瘤細胞缺乏 腫瘤抗原的呈遞；巨噬細胞與腫瘤的關聯，該巨噬細胞表達降低免疫應答的細胞因子；以 及調節性T細胞（Tregs)的免疫抑制活性。對腫瘤的免疫應答的缺乏還可以由以下事實引 起：腫瘤細胞傾向于不表達那些刺激先天性免疫應答的分子，即刺激Toll樣受體（TLRs)或 核苷酸結合寡聚化結構域（N0D)樣受體的分子。癌癥包括實體腫瘤以及諸如白血病和骨髓 發育不良綜合征的血液癌癥。
[0007] 免疫系統包括細胞免疫、體液免疫、補體反應（complement response)。細胞免疫 包括多種細胞和多種活動的網絡，涉及樹突細胞、CD8+T細胞（細胞毒性T細胞；細胞毒性淋 巴細胞）和CD4+T細胞（輔助T細胞）。樹突細胞（Dendritic cells，DCs)獲得多肽抗原， 其中這些抗原可以從DC的外部獲得，也可以在DC的內部由感染生物體來生物合成。DC處 理多肽，得到長度約10個氨基酸的肽，并將這些肽傳輸給MHC I類或MHC II類以形成復合 體，并將復合體運（shuttles)到DC的表面。當攜帶MHC I類/肽復合體的DC與CD8+T細 胞接觸時，結果是CD8+T細胞的活化和增殖。對于MHC II類所起的作用，當攜帶MHC II類 /肽復合體的DC與CD4+T細胞接觸時，其結果是CD4+T細胞的活化和增殖（Munz等（2010) Curr.Opin. Immunol. 22 :89-93 ；Monaco (1995)J. Leukocyte Biol. 57 :543-547 ；Robinson 等（2002) Immunology 105 :252-262)。盡管呈遞抗原給T細胞的樹突細胞能夠"活化"該T 細胞，活化的T細胞可能不能夠具有有效的免疫應答。CD8+T細胞的有效的免疫應答通常需 要DC通過一次或多次多個交互來在先刺激（prior stimulation)。這些交互包括⑶4+T細 胞與DC的直接接觸（通過⑶4+Τ細胞的⑶40配體與DCs的⑶40受體接觸的方式），或者 TLR激動劑與樹突細胞的toll樣受體（TLRs)中的一個受體的直接接觸。
[0008] 體液免疫涉及B細胞和抗體。B細胞被轉化成漿細胞，漿細胞表達并分泌抗體。 初始B細胞的區別在于它們不表達標志物（marker) CD27，而抗原特異性B細胞則表達 CD27(Perez_Andres等（2010)Cytometry Part B 78B(Suppl.l)S47_S60)。分泌的抗體隨后 可以與駐留在腫瘤細胞表面上的腫瘤抗原結合。結果是受感染的細胞或腫瘤細胞被抗體標 記。隨著抗體與受感染的細胞或腫瘤細胞的結合，結合的抗體介導（mediates)殺滅受感染 的細胞或腫瘤細胞，其中殺滅細胞是由NK細胞進行的。盡管并沒有以配置T細胞來識別靶 抗原的方式對NK細胞進行配置來識別特定的靶抗原，但是NK細胞與抗體的恒定區域結合 的能力使得NK細胞能夠特異性地殺滅抗體所標記的細胞。NK細胞對抗體的識別是由與抗 體的Fc部分結合的（NK細胞的）Fc受體介導的。這種類型的殺滅被稱為抗體依賴性細胞 毒作用（ADCC)。NK細胞也可以不依賴ADCC機理來殺滅細胞，在這種情況下這種殺滅需要 在靶細胞中MHC I類的表達損失或缺乏（參見例如Caligiuri(2008)Blood 112 :461-469)。
[0009] 可以使用"遲發型超敏反應"（delayed type hypersensitivity response)技術 來區分主要涉及細胞免疫的免疫應答或主要涉及體液免疫的免疫應答。遲發型超敏反應的 陽性信號表明細胞應答（參見，例如Roychowdhury等（2005)AAPS J.E834-E846)。
[0010] 自噬是一個穩態過程，細胞溶質（cytosolic)成分和細胞器通過該過程被輸送到 溶酶體降解。自噬也與細胞內病原體的先天性免疫應答和適應性免疫應答有關，細胞溶質 抗原借助于細胞內病原體而被負載到主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC) II類分子上，用于CD4+T細胞識別。
[0011] 說明
[0012] 本文中使用時，包括所附權利要求書中使用時，除文本另有明確說明外，諸如"一 個"、"一種"（"a"和"an"）和"所述"的詞語的單數形式包括其相應的復數指示物。本文 中所引用的所有參考文獻通過引用并入本文，并入的程度如同明確且單獨地指出各個出版 物、專利、公開的專利申請和序列表以及在所述公開和專利文獻中的圖片和照片通過引用 并入本文一樣。
[0013] 發明概述
[0014] 本發明提供制備樹突細胞疫苗的方法，其包括用防止細胞分裂的試劑處理從第一 受試者獲得的黑色素瘤細胞，用IFN-γ或IFN-γ模擬物（mimetic)處理黑色素瘤細胞， 選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細胞，并且將所選擇的黑色素瘤細胞與來自相同第一受 試者的自體樹突細胞接觸。本發明還提供包含通過上述方法所制得的樹突細胞疫苗的組合 物。本發明還提供的是刺激對黑色素瘤特異性抗原的免疫應答的方法，其包括向患有黑色 素瘤的受試者施用/給藥（administering)上述組合物。
[0015] 疫苗包含來自患有黑色素瘤的給定受試者的哺乳動物樹突細胞群落，并且其中受 試者含有黑色素瘤細胞，其中當在體外用IFN-γ或IFN-γ模擬物處理時，受試者所包含的 黑色素瘤細胞包括自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細胞，其中樹突細胞包含黑色素瘤特異性 肽抗原，其中所述黑色素瘤特異性肽抗原被樹突細胞從所述黑色素瘤細胞（或者在所述黑 色素瘤細胞）體外獲得，其中樹突細胞所包含的超過60%的黑色素瘤特異性肽來自自噬性 和非凋亡性的黑色素瘤細胞，其中樹突細胞所包含的小于40%的黑色素瘤特異性肽來自非 自噬性和凋亡性的黑色素瘤細胞，并且其中樹突細胞和黑色素瘤細胞來自相同的受試者。 本發明還提供上述樹突細胞群落，其中通過粘附到表面來獲得自噬性和非凋亡性的黑色素 瘤細胞。
[0016] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，超過80%的黑色素瘤特異性肽來自 自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細胞，并且其中小于20%的黑色素瘤特異性肽來自非自噬性 和凋亡性的黑色素瘤細胞。
[0017] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，超過90%的黑色素瘤特異性肽來自 自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細胞，并且其中小于10 %的黑色素瘤特異性肽來自非自噬性 和凋亡性的黑色素瘤細胞。
[0018] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽均 來自不能細胞分裂的黑色素瘤細胞。
[0019] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽來 自由于黑色素瘤細胞受到輻照而不能細胞分裂的黑色素瘤細胞。
[0020] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有的黑色素瘤特異性肽來 自由于黑色素瘤細胞的染色體被核酸交聯劑交聯而不能細胞分裂的黑色素瘤細胞。
[0021] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，所有的黑色素瘤特異性肽來自 IFN-γ處理過或IFN-γ模擬物處理過的黑色素瘤細胞。
[0022] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，所有的黑色素瘤特異性肽來自未經 IFN-γ處理過或未經IFN-γ模擬物處理過的黑色素瘤細胞。
[0023] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤細胞的第一數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤細胞的第二數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數目和第二數目二者均指的是 黑色素瘤特異性抗原類的數目，黑色素瘤特異性抗原類是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的一種，并且其中所述超過60%是從第一數目獲得 的，并且其中所述小于40 %是從第二數目獲得的。
[0024] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤細胞的第一數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤細胞的第二數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數目和第二數目二者均指的是 黑色素瘤特異性抗原類的數目，黑色素瘤特異性抗原類是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的兩種，并且其中所述超過60%是從第一數目獲得 的，并且其中所述小于40 %是從第二數目獲得的。
[0025] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，存在來自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤細胞的第一數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中存在來自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤細胞的第二數目的黑色素瘤特異性肽，并且其中所述第一數目和第二數目二者均指的是 黑色素瘤特異性抗原類的數目，黑色素瘤特異性抗原類是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的三種，并且其中所述超過60%是從第一數目獲得 的，并且其中所述小于40 %是從第二數目獲得的。其他實施方式使用上述抗原中的四種、五 種、六種、七種或八種。本發明還包含完全不同的黑色素瘤特異性抗原的用途。
[0026] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有黑色素瘤特異性肽來自 經IFN-γ處理的黑色素瘤細胞。
[0027] 本發明公開了一種疫苗，其中在某些情況下，基本上所有黑色素瘤特異性肽來自 在體外經處理而不能細胞分裂的黑色素瘤細胞。本發明還包括上述疫苗，其中給定受試者 是人類受試者。
[0028] 此外，本發明提供疫苗，其中給定受試者是非人的哺乳動物。
[0029] 本發明公開了刺激對黑色素瘤特異性抗原的免疫應答的方法，其包括向受試者施 用免疫刺激量的上述疫苗。
[0030] 本發明公開了一種方法，其中受刺激的免疫應答包括⑶4+T細胞應答、⑶8 +T細胞 應答和Β細胞應答中的一種或多種。
[0031] 本發明公開了一種方法，其中通過ELISP0T測定、通過細胞內細胞因子染色測定、 通過四聚體測定、或者通過檢測抗原特異性抗體的產生來測定CD4+T細胞應答、CD8+T細胞 應答或B細胞應答。
[0032] 本發明公開了一種方法，其中免疫應答包括含有2年總生存率（0S)的生存時間， 并且其中2年總生存率至少為60%。
[0033] 此外，本發明提供了上述方法，其中所述施用包括皮下注射疫苗。
[0034] 本發明公開了一種方法，其中施用包括將每周給予的疫苗注射三個月，然后每月 給予的疫苗注射五個月。
[0035] 本發明公開了制備樹突細胞疫苗的方法。
[0036] 本發明公開了制備樹突細胞疫苗的方法，該樹突細胞疫苗包含來自相同受試者的 黑色素瘤細胞和樹突細胞，其中用防止細胞分裂的試劑處理一種或多種（一個或多個）黑 色素瘤細胞，其中用干擾素 -γ (IFN-γ)或IFN-γ模擬物在體外處理所述一種或多種黑色 素瘤細胞，其中選擇自噬性和非凋亡性的黑色素瘤細胞，其中丟棄非自噬性和凋亡性的黑 色素瘤細胞，并且其中向一種或多種自體樹突細胞提供所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤 細胞，或者其中向一種或多種自體樹突細胞提供衍生自所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤 細胞的肽。
[0037] 本發明公開包含至少一種經干擾素（IFN)-y處理的來自第一受試者的黑色素瘤 細胞和至少一種來自相同第一受試者的抗原呈遞細胞（APCs)的組合物，其中黑色素瘤細 胞是：自噬性的；非凋亡性的；并且表達MHC II類分子。在另一方面，本發明包括上述組合 物，其中經IFN-γ處理的黑色素瘤細胞負載到APC中；以及上述組合物，其中經IFN-γ處 理的黑色素瘤細胞未負載到APC中。在另一方面，本發明包含上述組合物，其中黑色素瘤細 胞來自患有 I 期（Stage 1)、11 期（Stage II)、111 期（Stage III)或 IV 期（Stage IV)黑 色素瘤的受試者。此外，本發明涉及上述組合物、相關的試劑盒和相關的方法，其中APC包 含至少一種樹突細胞。
[0038] 在一個方面，本發明的藥物組合物、試劑和相關的方法利用癌癥細胞的制劑，該制 劑在IFN-γ處理后為7-AAD陰性并且annexin V陰性。這種群落（population)的非限制 性例子可以是，例如約99% 7-AAD陰性和約99% annexin V陰性、或者至少約95% 7-AAD 陰性和約95% annexin V陰性、或者至少約90% 7-AAD陰性和約90% annexin V陰性。
[0039] 此外，本發明包含上述組合物，其中自噬是通過如下測試證明的，該測試測定微 管相關蛋白輕鏈3(1X3);以及上述組合物，其中使用7-氨基放線菌素 D(7-AAD)試劑或 annexin(膜聯蛋白）試劑中至少一種來證明細胞是非凋亡性的。
[0040] 在方法方面，本發明提供制造如上所述組合物的方法，其包括從第一受試者中去 除至少一種黑色素瘤細胞，從第一受試者中去除至少一種APC，并且允許黑色素瘤細胞與 APC接觸；以及刺激對受試者或患者中黑色素瘤的免疫應答的方法，其包含向受試者施用 上述組合物。
[0041] 本發明涉及一種方法，其中來自患者的黑色素瘤細胞是非凋亡性的，是自噬性的， 并且其中黑色素瘤細胞通過表達MHC II類分子來對加入的IFN-γ做出應答；以及上述方 法，其中在負載到抗原呈遞細胞上之前，輻照黑色素瘤細胞。
[0042] 本發明涉及治療黑色素瘤患者中黑色素瘤的方法，其包括確定黑色素瘤細胞對 IFN-γ的促凋亡作用不敏感，并給受試者施用一種或多種如上組合物。
[0043] 在另一方面，本發明提供刺激或增強對黑色素瘤患者中黑色素瘤的免疫應答的方 法，其包括確定黑色素瘤細胞對IFN-γ的促凋亡作用不敏感，并給受試者施用一種或多種 如上所述的組合物。還提供上述方法，其中免疫應答是體液免疫應答、細胞免疫應答和先天 性免疫應答中的一種或多種。
[0044] 在試劑盒方面，本發明提供用于測試對受試者中腫瘤抗原的免疫應答的試劑盒， 其中通過一種或多種上述方